3. Nội dung nghiên cứu
2.3.4. Kỹ thuật tách dòng gen (cloning)
2.3.4.1. Ligase: Gắn đoạn gen quan tâm vào vector tách dòng pBT
- Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector tách dòng:
Thành phần Thể tích DNA 5µl H2O 2µl T4 Ligase 1µl Ligation buffer 10X 1µl - Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong vòng 1 giờ 30 phút.
2.3.4.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α
Bƣớc 1: Tế bào khả biến lấy từ tủ âm - 830C đã đƣợc rã đông trên đá trong thời gian 30 phút.
Bƣớc 2: Bổ sung 10µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và đảo nhẹ. Bƣớc 3: Giữ trên đá 30 phút.
Bƣớc 4: Sốc nhiệt ở 420
C trong vòng 1 phút 30 giây. Bƣớc 5: Để ở trong đá 1 - 2 phút.
Bƣớc 6: Bổ sung 150µl môi trƣờng LB lỏng.
Bƣớc 7: Nuôi lắc ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ
Bƣớc 8: Cấy trải trên đĩa chứa môi trƣờng LB đặc có bổ sung cabenicilin Thành phần môi trƣờng trong một đĩa gồm:
LB đặc 20ml IPTG 20µl X - gal 40µl Carbenicilin 20µl
Sử dụng que cấy đã đƣợc vô trùng để cấy trải 150µl dịch khuẩn lên đĩa petri có chứa môi trƣờng LB đặc. Trải đều dịch khuẩn sao cho bề mặt đĩa khô bóng là đƣợc.
Bƣớc 9: Ủ ở 370
C trong vòng 16 - 18 giờ.
- Khi bề mặt đĩa thạch xuất hiện các tế bào xanh, trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng chấm vào 3ml LB lỏng có chứa kháng sinh cabenicilin với nồng độ 100µg/ml.
- Lấy 1μl dịch khuẩn làm phản ứng PCR để kiểm tra đoạn gen đã biến nạp thành công hay chƣa (thực hiện giống phản ứng PCR nhân dòng gen). Sau đó điện
di kiểm tra kết quả PCR, nếu xuất hiện vạch tƣơng ứng với đoạnh gen biến nạp (katG và inhA) thì tiến hành tách plasmid các mẫu đó.
2.3.4.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng Kit.
Bƣớc 1: Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi lỏng qua đêm vào ống eppendorf 2ml. Bƣớc 2: Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, đổ dịch thu cặn
Bƣớc 3: Thêm 150µl buffer 1, votex nhẹ cho tan hết cạn tế bào Bƣớc 4: Thêm 150µl buffer 2
Bƣớc 5: Thêm 300µl buffer 3, đảo nhẹ và nhanh Bƣớc 6: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút ở 40
C Bƣớc 7: Chuyển dịch thu đƣợc vào cột tách plasmid. Bƣớc 8: Thêm 500µl buffer 4.
Bƣớc 9: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 40
C.
Bƣớc 10: Loại bỏ dịch qua cột, chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml.
Bƣớc 11: Thêm 50µl buffer 5, đợi khoảng 1 - 2 phút cho nƣớc thấm hết màng lọc.
Bƣớc 12: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 40
C. Bƣớc 13: Bỏ cột, điện di kiểm tra.
2.3.4.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp bằng Sol.
Bƣớc 1: Hút 1800µl dịch khuẩn lỏng sang ống eppendorf 2ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C rồi đổ dịch thu cặn khuẩn lạc.
Bƣớc 2: Thêm 100µl sol 1, làm tan cặn khuẩn bằng máy vontex.
Bƣớc 3: Thêm 200µl sol 2, đảo nhẹ lên xuống 3 - 4 lần. Giữ trên đá 1 phút. Bƣớc 4: Thêm 150µl sol 3, đảo nhanh ngay sau khi cho sol 3 vào để tránh kết tủa cục bộ, giữ ở 00
Bƣớc 5 : Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. hút dịch chuyển sang ống eppendorf 2ml bỏ cặn.
Bƣớc 6: Thêm một lƣợng chloroform : isoamyl tỉ lệ 24 : 1. Lắc mạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C. Hỗn hợp sẽ chia thành 2 pha, ta hút pha trên sang ống eppendorf 1,5ml.
Bƣớc 7: Tủa acid nucleic bằng cách bổ sung một lƣợng đƣơng isopropanol đảo đều ủ ở - 200C trong 30 phút hoặc 2 lần thể tích ethanol 98%, đảo đều và ủ ở - 200C trong 3 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40
C.
Bƣớc 8: Rửa bằng cồn 70% với một lƣợng tƣơng đƣơng. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 8 phút ở 40C. Đổ dịch thu cặn và làm khô.
Bƣớc 9: Thêm 50µl nƣớc deion có chứa RNAase hoặc dung dịch TE pH8.
2.3.4.5. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid
Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI để cắt plasmid. Theo nhƣ sơ đồ vector pBT thì chỉ cần một enzyme này là có thể cắt ở cả hai đầu phía trƣớc vị trí của đoạn gen chèn vào. Kết quả thực hiện phản ứng cắt sẽ thu đƣợc hai phần: Tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thƣớc 684bp (đối với gen katG) và 501bp (đối với gen
inhA) và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2705bp. Thành phần phản ứng cắt plasmid: Thành phần Thể tích - 10X BamHI buffer: 2µl - BamHI enzyme: 1µl - DNA plasmid: 5µl - Nƣớc khử ion 12µl Tổng thể tích 20 µl
Sản phẩm đƣợc tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 120 phút. Sau đó điện di trong agarose 1%, nhuộm Ethidium bromide kiểm tra vạch đặc hiệu. Những
mẫu nào có vạch tƣơng ứng với vị trí 684bp (đối với gen katG) và 501bp (đối với gen inhA) thì có thể sử dụng để đọc trình tự.
Sau khi xác định đƣợc mẫu plasmid đi đọc trình tự, pha loãng plasmid 50 lần rồi hút 10µl mẫu đó cho vào Eppendorf, bổ sung thêm 5µl RNAase. Sản phẩm đƣợc tiến hành ở bể ổn nhiệt 370
C trong vòng 120 phút để khử RNA.
2.3.4.6. Phƣơng pháp đọc trình tự DNA theo Sanger
Trình tự nucleotide đƣợc xác định trên máy đọc trình tự, tự động tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học.
+ Phân tích kết quả:
- Kiểm tra kết quả thu đƣợc bằng phần mềm máy tính ABI3130.
- Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen, thiết lập chủng wild type để so sánh. - Xử lý, phân tích các trình tự gen katG và gen inhA có kích thƣớc khoảng 684bp và 501bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chƣơng trình phân tích chuỗi BioEdit. So sánh đối chiếu với các dữ liệu ở ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu.
Xử lý số liệu theo phƣơng pháp thống kê, sử dụng chƣơng trình phân tích sinh học Star View v5.0 để xác định các mối liên quan kháng thuốc.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN