L ỜI CẢM ƠN
2) Môi trường:
2.2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme kỹ thuật
Nuôi sinh enzyme chitinase Ly tâm Dịch chứa enzyme Kết tủa Chế phẩm enzyme chitinase kỹ thuật -Tác nhân kết tủa: + Loại tác nhân + Nồngđộ
1. Nuôi chủng vi khuẩn sinh enzyme chitinase
Sau khi tìm được chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme chitinase cao ta đem bảo
quản ở nhiệt độ thích hợp. Chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu được bảo quản
trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Khi sử dụng, chủng giống này được hoạt hoá bằng cách đem cấy chuyền sang môi trường thạch nghiêng, đặt trong tủ ấm 370C sau 24-48 giờ.
Nhân giống cấp 1: giống sau khi phát triển tốt được cấy chuyền sang bình tam giác chứa 10ml dịch môi trường đã chọn (môi trường tối ưu tìm được ở thí nghiệm trên). Lắc bình cấy chủng ở máy lắc 220vòng/phút trong các
điều kiện đã tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian).
Nhân giống cấp 2: chủng vi khuẩn nhân giống cấp 1 sau khi đã phát triển
tốt được chuyển sang bình nhân giống cấp 2 ở môi trường lỏng đựng trong
bình tam giác với tỉ lệ là 10% giống. Nhân giống cấp 2 trong diều kiện tương tự như trên (môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian).
2. Tiến hành ly tâm
Sau khi nhân giống cấp 2 thu enzyme ngoại bào chitinase bằng cách ly
tâm ở 8000vòng/15phút. Dịch enzyme sau khi thu được đem kết tủa để thu chế
phẩm enzyme kỹ thuật chitinase.
3. Kết tủa enzyme
Kết tủa enzyme dạng dịch ta thu được chế phẩm enzyme kỹ thuật chitinase.
Một số yếu tố trong quá trình kết tủa cũng ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme chitinase.
▪ Xác định loại tác nhân kết tủa thích hợp
Cố định thời gian kết tủa = 24h, nhiệt độ kết tủa to = 4oC, sử dụng ba tác
nhân kết tủa khác nhau: Ethanol 70%, Aceton 70% và (NH4)2SO4 bão hòa.
Sử dụng ethanol 96% và aceton 99,5% (đã được làm lạnh xuống 4oC) cho từ
Chuẩn bị chitin: Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định
hoạt tính của enzyme chitinase cần phải huyền phù hóa chitin, làm tăng khả năng
tiếp xúc của enzyme chitinase với chitin trong quá trình thủy phân. Huyền phù
chitin thu được đem bảo quản lạnh sử dụng cho nghiên cứu. Chuẩn bị huyền phù
chitin được trình bày trong phụ lục .
Huyền phù chitin có các chỉ tiêu chất lượng như sau:
Màu sắc: trắng đục
Trạng thái: dạng bột nhão, mịn Độ ẩm: 75%
Sau đó tiến hành xác định hoạtđộ enzyme theo phương pháp Nelson-morgan, từ đó tìm được tác nhân kết tủa thích hợp cho quá trình sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật chitinase.
▪ Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chất kết tủa thích hợp:
Cố định thời gian kết tủa = 24h, nhiệt độ kết tủa to = 4oC, chất kết tủa
thích hợp đã tìm được ở thí nghiệm trên. Dịch chứa enzyme Kết tủa bằng Ethanol Aceton (NH4)2SO4 Xác định hoạt độ enzyme chitinase Tác nhân kết tủa thích hợp
Sau thời gian là 24 giờ kết tủa, loại bỏ dung môi và thu kết tủa là enzyme kỹ
thuật chitinase. Sau đó đem enzyme kỹ thuật chitinase đi bảo quản lạnh để sử dụng.