L ỜI CẢM ƠN
2) Môi trường:
2.2.8. Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật
(phương pháp phân loại cổ điển )
Phương pháp phân loại cổ điển là phương pháp phân loại chủng vi sinh vật dựa vào các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá. Dựa vào đó, người
ta phân loại chúng vào các chi [21],[22].
Nhuộm Gram: Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị vết bôi: dung que cấy vô trùng lấy ít vi khuẩn từ thạch (sử dụng
tế bào vi khuẩn được nuôi trong 24 giờ để làm tiêu bản) hoà vào 1 giọt nước cất ở
giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa bằng nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Dịch chứa enzyme Kết tủa Tác nhân kết tủa Xác định hoạt độ enzyme chitinase Nồngđộ chất kết tủa (%) 60 65 70 75 80 Nồngđộ chất kết tủa thích hợp
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để
khô trong không khí.
- Soi kính: dung vật kính dầu 100x.
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.
Đặc điểm về hình thái tế bào và hình dạng khuẩn lạc.
- Để quan sát hình dạng khuẩn lạc của chủng vi khuẩn, ta tiến hành cấy ria trên môi trường thạch thường, sau 1 ngày lấy ra quan sát.
- Để quan sát hình thái tế bào, lấy 1 vòng que cấy hoà vào 1 giọt nước trên lam kính, đậy lamem rồi quan sát dưới kính hiển vi.
Xác định khả năng sinh bào tử.
cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường. Sau 3 ngày xử lý nhiệt ở 800C. Dùng vi khuẩn đã xử lý nhiệt cấy lại trên đĩa thạch thường đặt ở 300C. Sau 1 ngày nếu xuất hiện khuẩn lạc thì kết luận chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử.
Nếu không thì kết luận ngược lại.
Xác định khả năng hoá lỏng gelatin.
Cấy vi khuẩn theo phương thẳng đứng, sâu vào ống nghiệm môi trường gelatin đứng. sau 1 ngày đặt ở 300C, lấy ống nghiệm ra giữ ở 40C trong 1 giờ. Kiểm tra
kết quả nếu thấy môi trường vẫn lỏng thì kết luận có khả năng hoá lỏng gelatin. Ngược lại là không có khả năng hóa lỏng gelatin.
Xác định khả năng sinh khí CO2.
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường thạch thường dịch thể đã đặt ống Durham. Đặt ở 300C, sau 1 ngày kiểm tra nếu thấy ống Durham nổi lên, kết luận có khả năng sinh khí. Ngược lại kết luận không có khả năng sinh khí CO2.
Xác định hoạt tính catalaza
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường thạch thường dịch thể , đặt ở
300C. Sau 1 ngày, nhỏ 2 giọt H2O2 vào dịch nuôi cấy. Nếu sủi bọt ta kết luận có
hoạt tính catalaza. Ngược lại không có hoạt tính.
Xác định khả năng chịu muối.
Cấy vi khuẩn lên đĩa Peptri chứa môi trường thạch thường với các nồng độ muối
khác nhau từ 1 – 12%, giữ trong tủ ấm. Sau 1 ngày lấy ra xem, nếu vi khuẩn mọc được, ta kết luận chúng có khả năng chịu muối, ngược lại thì không có khả năng
chịu muối.
Xác định khả năng sinh acid.
Sau khi khử trùng, đổ môi trường ra các đĩa Peptri. Cấy vi khuẩn thành các vạch
vùng trong suốt, chứng tỏ vi khuẩn có tiết acid. Acid sinh ra bởi chủng vi khuẩn
khuếch tán ra môi trường làm tan CaCO3 (có màu trắng đục) xuất hiện xung quanh khuẩn lạc.
Xác định khả năng khử nitrat thành nitrit.
Nuôi cấy lắc vi khuẩn với vận tốc 220vòng/phút. Sau 2 ngày, lấy dịch nuôi
cấy ly tâm. Dùng thuốc thử Signet để đo nồng độ nitrit trong dịch sau nuôi cấy (tại bước sóng 520nm)