L ỜI CẢM ƠN
3.6.PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP CỔ ĐIỂN.
2) Môi trường:
3.6.PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP CỔ ĐIỂN.
Tiến hành các phương pháp xác định đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hoá của chủng vi khuẩn, kết quả được ghi ở bảng sau:
Bảng 15: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của chủng vi khuẩn lựa chọn.
Đặc điểm T2.3
Khả năng chịu muối (1 – 12 )%
Hình thái khuẩn lạc Màu trắng, nhẵn, bóng ướt, không có tua
Hình dạng tế bào Dạng chuỗi là chính, có dạng đơn lẻ…
Khả năng hình thành bào tử +
Gram +
Hiếu khí bắt buộc +
Hoạt tính catalaza +
Khả năng sinhacid từ glucose _
Khử nitrat thành nitrit +
Hoá lỏng gelatin _
Khả năng sinh CO2 _
Đối chiếu với bản mô tả của Bergey có thể khẳng định chủng vi khuẩn đã nghiên cứu T2.3 thuộc chi Bacillus.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Sau quá trình nghiên cứu đã đạt được các kết quả:
1.Từ nhiều chủng vi khuẩn có khả năng phân giải chitinase phân lập từ đất trong đảo, vùng ven bờ biển thuộc tỉnh Khánh Hoà đã tuyển chọn được một chủng
có hoạt tính enzyme chitinase cao nhất, ký hiệu là T2.3.
2.Chủng vi khuẩn nghiên cứu đều sinh trưởng và sinh enzyme chitinase mạnh ở môi trường có pH 8, nhiệt độ từ (30-35)0C, thời gian nuôi cấy từ 36-48 giờ, thích hợp nhất với môi trường V.
3.Chitinase của chủng T2.3 có thể hoạt động ở khoảng pH (pH 7-8), và nhiệt độ thích hợp (30-40)0C, có thể bảo quản enzyme ở -200C trong 1 tháng mà hoạt tính không giảm đáng kể. Chủng T2.3 đều có khả năng sinh trưởng và sinh enzyme mạnh khi lên men xốp trên các cơ chất là bột cám và bột ngô.
4.Để thu được chế phẩm enzyme chitinase kỹ thuật có hoạt độ cao thì dùng tác nhân kết tủa là aceton 99,5% bổ sung vào dịch chứa enzyme để đạt được nồng độ là 70% (ở 4oC). Sau thời gian là 24 giờ, loại bỏ dung môi và thu kết tủa là enzyme kỹ thuật chitinase. Sau đó đem chitinase kỹ thuật đi bảo quản lạnh để sử
dụng. Enzyme chitinase kỹ thuật thu được có hoạtđộ là 25.231U/g enzyme.
5.Phân loại chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn nghiên cứu T2.3 thuộc chi
Bacillus
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Qua quá trình nghiên cứu cho phép đề xuất một số ý kiến sau:
1.Khảo sát thêm ảnh hưởng của các chất hoạt hóa, các chất ức chế đến hoạt
tính enzyme chitinase của chủng T2.3.
2. Tiếp tục nghiên cứu khả năng thủy phân của enzyme chitinase từ chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
T2.3 đối với chitin ở nhữngđiều kiện khác nhau.
3. Đề tài mới bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitinase kỹ
thuật từ chủng vi khuẩn T2.3, cần tiếp tục nghiên cứu tinh sạch enzyme chitinase. 4. Tiếp tục nghiên cứu thêm khả năng sinh enzyme chitinase của một số
chủng có hoạt tính phân giải các chất hữu cơ cao đã phân lậpđược.
5. Tiếp tục sử dụng một số phương pháp phân loại vi sinh vật hiệnđại hơn như
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bộ Thủy sản (2003), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, Nhà xuất
bản nông nghiệp.
2. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản
khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme
protease từ B. subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học
Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998),
Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,
Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, P hạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật,
Hà Nội
6. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Đại học
Quốc gia Hà Nội.
7. Nguyễn Hữu Hiệp (2006), Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
8. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
9. Đặng Văn Hợp (2000), Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất protease từ
Asperigillus oryzae A4 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm, Luận án tiến sĩ
kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
10. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2003), Thực tập vi sinh
vật học thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật TP . Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất
bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Trần Thị Luyến (2004), “Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp Bộ
sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản (vỏ tôm, vỏ ghẹ)”, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang.
13. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2006), Sản xuất các chế
phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
và Kỹ thuật, Hà Nội.
14. Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu thủy phân protein cá bằng proteaza nội tạng
cá, mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân, Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Trường Đại học Thủy sản, Nha Trang.
15. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, P hạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982),
Enzyme vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
16. Phạm Văn Ty, Đào Thị Lương, Trần Thị Thanh Huyền (2004), Nghiên cứu sử
dụng vi khuẩn ưa nhiệt phân giải chitin vỏ tôm cua làm thức ăn chăn nuôi, Di truyền học và ứng dụng-Chuyên san Công nghệ sinh học, Hội di truyền học
Việt Nam.p22-26
.17. Trần Cẩm Vân (2002), Giáo trình Vi sinh vật học môi trường, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
18. Nguyễn Thị Xuyến (1996), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP.Hồ
Chí Minh.
TIẾNG ANH
19. A. Loredo, R. Rodriguez-Herrera, J. C. Montanez, A. V. Charles-Rodríguez (2005), “Chitosan-oligosaccharides production by endo-chitosanase and their fungal inhibition capacity in corn tortillas”, Nutraceutical & Functional Foods General I , Session 35.
20. A-M.Botha (1998), ’’ Chitinasa isoenzymes in near – isogenic wheat lines challenged with Russian wheat apid, exogenous, ethylene, and mechanical wounding’’, Bot.Bul.Acad.Sin, 39, pp.99-106.
21. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol 4,1998
22. Berdey J. (1984), ‘‘Screening, classification of microbial product’’, pp.9-20. 23. Cohen- Kupiec, R. Chet, I. (1998), ’’ The molecular biology of chitin
digestion’’, Curr Opin Biotechnol, 226, pp. 147-159.
24. Herrera- Estrella, A. Chet, I. (1999), ‘‘ Chitinases in biological control’’, EXS, 87, pp. 171-184.
25. PhD Thesis Cédric F.V. Hobel, (2004), ’’ Access to Biodiversity and New Genes from Thermophiles by Special Enrichment Methos’’.
26. Robbin, P. W, C.Albright, and B- benfielad (1988), ’’ Cloning and expression of a Streptomyces pilatus chitinase (chitinase-63) in Escherichia coli’’, J.boil Chem, 263, pp. 443-447.
27. http: // vietscience.free.fr.
28. Klaus-D. Spindler. (1997), Chitinase and chitosanase assays, Universitat Ulm, Germany
29. Masahiro Matsumiya, Yasuyuki Arakane, Atsunobu Haga, Subaratnam Muthukrishnan and Karl J. Kramer. (2006), Substrate Specificity of Chitinases from Two Species of Fish, Greenling, Hexagrammos otakii, and Common Mackerel, Scomber japonicus, and the Insect, Tobacco Hornworm, Manduca sexta, 70 (4), 971–979, Department of Marine Science and Resources, College of Bioresource Sciences, Nihon University, Fujisawa, Kanagawa 252-8510, Japan, Department of Biochemistry, Kansas State University, Manhattan, Kansas 66506, USA.
PHỤ LỤC
Phụ lục 01:
Bảng 03: Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng sinh chitinase của chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nghiên cứu (T2.3)
Môi trường Khả năng sinh
Trưởng (OD620nm)
Hoạt tính enzyme
(D-d, mm) pH sau nuôi cấy
I 1.5717 30 7.86
II 0.9035 29 7.43
III 1.1223 27 8.44
IV 0.7301 25 7.31
V 1.3961 32 8.68
Bảng 04: Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh chitinase của chủng nghiên cứu
pH Khả năng sinh
Trưởng (OD620nm)
Hoạt tính enzyme
(D-d, mm) pH sau nuôi cấy
3 1.0310 14 5.72 4 1.2314 23 7.83 5 1.4827 25 8.76 6 1.5239 26 8.73 7 1.9070 29 8.58 8 2.1021 31 8.67 9 1.8972 27 8.64
Bảng 05: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh chitinase của
chủng nghiên cứu.
Nhiệt độ (0C) Khả năng sinh Trưởng (OD620nm) Hoạt tính enzyme (D-d, mm) pH sau nuôi 200C 1.1601 15 8.21 250C 1.5427 26 8.32 300C 1.9124 31 8.65 350C 1.8925 31 8.44 400C 1.6235 28 8.32 450C 1.5021 25 8.36 500C 1.4245 23 8.51
Bảng 06: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh chitinase
Thời gian Khả năng sinh
Trưởng (OD620nm) Hoạt tính enzyme (D-d, mm) pH sau nuôi 0 giờ 0.2405 0 8 6giờ 0.8956 20 8 12 giờ 1.2450 26 7.64 18giờ 1.3598 26 7.60 24 giờ 1.6612 27 7.93 30 giờ 1.7357 28 8.25 36 giờ 1.9846 31 8.66 42 giờ 2.2021 32 8.62 48 giờ 1.9981 31 8.62 52 giờ 1.7652 28 8.52 60giờ 1.6689 27 8.34 Phu luc 02:
Bảng 07: Hoạt tính chitinase của chủng khi nuôi cấy trên các môi
trường xốp khác nhau Môi trường Lên men xốp Bột ngô Bột ngô: bột vỏ tôm (1:1) Cám Cám: bột vỏ tôm (1:1) Hoạt tính enzyme (D-d, mm) 30 29 28 30 Phụ lục 03:
Bảng 08: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chitinase của chủng vi khuẩn T2.3
pH 2 3 4 5 6 7 8 9
Hoạt tính chitinase
Bảng 09: Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính chitinase của
chủng vi khuẩn T2.3
Thời gian 1tuần 2tuần 3tuần 4tuần (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hoạt tính chitinase
(D-d, mm) 28 29 26 25
Bảng 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chitinase của chủng vi khuẩn T2.3
Nhiệt độ (0C) 25 30 35 40 45 50 Hoạt tính chitinase
(D-d,mm) 23 30 29 27 22 17
Phụ lục 04:
Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase
1.Nguyên tắc:
Hoạt tính của enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm N-acetyl-β-D-glucosamine của quá trình phân giải chitin.
2.Cách tiến hành:
Chuẩn bị huyền phù chitin.
Do chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính của
enzyme chitinase cần phải huyền phù hóa chitin.
Lấy 5g chitin (tách chiết từ vỏ tôm) hòa tan trong 50 ml HCl đậm đặc,
khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở nhiệt độ 400C. Sau đó, chitin tạo thành huyền phù bằng cách thêm từ 500 ml nước cất lạnh (50C). Huyền phù chitin là phần bã thu được bằng cách lọc qua giấy lọc (hoặc là phần lắng lại dưới đáy của ống ly tâm nếu đem dịch ly tâm). Huyền phù thu được rửa với nước cất nhiều lần cho đến pH = 5. Huyền phù chitin được bảo quản lạnh .
Xác định hoạt tính của enzyme chitinase:
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1ml huyền phù chitin 1% và 1ml enzyme. Giữ
phản ứng ở nhiệt độ 300C trong thời gian 2 giờ. Sau đó phảnứng thủy phân được
ngừng lại bằng cách đun sôi dịch trong 3 phút. Lượng glucosamine thu được sau
phản ứng thủy phân bởi enzyme chitinase được xác định theo phương pháp Elson
3.Cách tính kết quả:
Một đơn vị hoạt tính (đvht) của enzyme chitinase tương đương với 1 µg
glucosamin tạo thành trong thời gian thủy phân chitin là 1 phút ở nhiệt độ phản ứng.
Đvht/g CPE = a.d.V/ v.t.m
a: hàm lượng glucosamine (µg/ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng. d: hệ số pha loãng.
V: thể tích enzyme ban đầu (ml).
v: thể tích enzyme thí nghiệm (ml).
t: thời gian phản ứng (phút).
m: khối lượng chế phẩm enzyme sử dụng (g).
Phương pháp XĐ lượng glucosamine theo phương pháp Elson – Morgan. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự hình thành các chất dẫn xuất pyrrole khi
glucosamin được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrole này sẽ
cho phản ứng màu với thuốc thử Ehrlich.
Đường amin hydroclorid được đun nóng với acetyl aceton trong dung dịch
kiềm trong khoảng 1 giờ trước khi thêm thuốc thử Ehrlich. Những lượng glucosamin tương đương sẽ cho ra cường độ màu tương đương trong cùng điều
kiện.
2.Pha chế thuốc thử:
Thuốc thử Ehrlich: 0,8 g p-dimethylaminobenzadehyd (DMAB) pha trong 30 ml dung dịch HCl đậm đặc.
Thuốc thử acetyl aceton: Pha 2,5 ml acetyl aceton trong 50 ml dung dịch đệm
cacbonat Na2CO3/NaHCO3 1N, pH = 9,6. 3.Dựng đồ thị glucosamin chuẩn;
Cân chính xác 0,1 g glucosamine, cho nước cất vào đủ 500 ml.
Chuẩn bị dung dịch glucosamin chuẩn có nồng độ 10mg/ml – 50 mg/ml theo bảng 2 dưới đây:
Bảng 11: Nồng độ glucosamine chuẩn trong dung dịch.
Nồng độ glucosamin chuẩn (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Thể tích dung dịch glucosamin (ml) 0 5 10 15 20 25 Thể tích nước cất (ml) 100 95 90 85 80 75 Dựng đường chuẩn theo các nồng độ trên:
4.Cách tiến hành:
Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày. Cho vào ống 1 ml dịch
thí nghiệm, 1 ml dịch thuốc thử acetyl aceton. Lắc đều, đun cách thủy ở 1000C trong 1 giờ, sau đó làm mát dưới dòng nước mát.
Thêm 1 ml thuốc thử Ehrlich, lắc đều, đun cách thủy ở 700C trong 15 phút.
Để nguội, dung dịch chuyển sang màu đỏ vào so màu ở bước sóng 512 nm. Nồng độ glucosamine dịch thủy phân được xác định dựa vào đường chuẩn glucosamine.
Bảng 12: Mối tương quan giữa hàm lượng glucosamine và độ hấp phụ:
Hàm lượng glucosamin (µg/ml) Độ hấp phụ 10 0.142 20 0.183 30 0.236 40 0.281 50 0.325 Hình : Đồ thị chuẩn glucosamine 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 10 20 30 40 50 Nồng độ Glucosamin (mcg/ml) O D
Bảng 13 : Ảnh hưởng của loại tác nhân kết tủa đến hoạt độ chitinase
Tác nhân kết tủa Tổng hoạt độ chitinase,
U/g enzyme Aceton 25.231 Ethanol 20.498 Ammonium sulphate 17.983 y= 0.0046x+ 0.094 R2= 0.99865
Bảng 14: Ảnh hưởng của nồng độ (%) aceton đến hoạt độ enzyme chitinase Nồng độ aceton, % Tổng hoạt độ chitinase, U/g enzyme 60 2.510 65 10.347 70 25.231 75 22.128 80 20.265 Phulục 05 : Phương pháp xác định độ ẩm.
Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở
nhiệt độ 100 – 1050C.
Nguyên lý: dùng nhiệt độ cao để bay hơi nước trong sản phẩm. Sau đó dựa
vào khối lượng mẫu trước và sau khi sấy để xác định độ ẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành xác định:
Sấy khô cốc nung 2 lần ở nhiệt độ 100 – 1050C đến khối lượng không đổi
(sấy khoảng 90 phút).
Cân p (g) mẫu cho vào cốc, sấy đến khối lượng không đổi. Tiến hành sấy 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: sấy ở nhiệt độ 60 – 800C trong 2 giờ. Giai đoạn 2: sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C trong 3 giờ.
Công thức xác định độ ẩm:
W = (G1 – G2)*100%/(G1 – G)
Trong đ ó:
W: Độ ẩm của mẫu (%)
G1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy.
G2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM
Hinh 20: Nhuộm Gram của vi khuẩn T2.3
Hình 22: Dịch enzyme chitinase sau khi ly tâm loại tế bào và kết tủa bằng
aceton 70%
Hình 23: Khả năng phân giải chitin của chủng T2.3
Hình 24: Bảo quản vi khuẩn T2.3 trong ống nghiệm