Chọn lọc ngẫu nhiên 20 khuẩn lạc mọc trên môi trường LB có chứa Cm, cấy tinh sạch trên môi trường LB + Cm. Chọn 1 khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa cấy tinh sạch, cấy vào môi trường lỏng NB không muối, không kháng sinh có bổ sung DAP để diễn ra quá trình trao đổi chéo giữa gen asd đột biến và gen asd gốc của vi khuẩn
S. choleraesuis, nuôi trong 6 giờ, sau đó pha loãng đến 10-5 và cấy trải đồng thời lên 2 loại môi trường.
Môi trường NA + DA.
Môi trường NA + DAP có chứa 5% sucrose.
Để chọn lọc những khuẩn lạc không có khả năng sinh trưởng trên môi trường có chứa sucrose. Những khuẩn lạc này là những chủng đã có trao đổi chéo gen làm mất đi SacB1, gen gây ức chế hoặc gây chết đối với vi khuẩn S. choleraesuis.
Tiếp tục sàng lọc những chủng không kháng sucrose trên môi trường LB+DAP chứa và không chứa Cm, sàng lọc trên môi trường LB có chứa và không chứa DAP để loại bỏ những chủng kháng sucrose do gen sacBI bị đột biến.
Cuối cùng các chủng chọn lọc được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi Pa5F - Pa6R và Pa6R - Pa7F
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ hệ gen của các chủng
S. choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B)
M asd Sal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M sal asd 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 500bp 500bp 1500bp 1500bp A B
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy gen asd của các chủng S. choleraesuis chọn lọc đều bị mất đi một đoạn gen có 14500 bp so với chủng S. choleraesuis Smith, phù hợp với những nghiên cứu trước [8]. Điều này chứng tỏ, Chúng tôi đã gây đột biến thành công gen asd trên chủng S. choleraesuis. Chúng tôi chọn lựa 1 chủng trong số các chủng gây đột biến thành công trên và kí hiệu là S. choleraesuis/Δasd để kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học và giải trình tự gen.