Các plasmid dùng trong kỹ thuật tạo dòng hay gọi là các thể mang gen cần có các đặc điểm sau:
Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc tế bào chủ.
Có các đặc tính mà giúp ta dễ dàng xác định tế bào có chúng. Mang những vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn.
Có kích thước càng nhỏ càng tốt, xâm nhập dễ dàng, sao chép nhanh và hiệu quả.
Các plasmid đã được cải tiến rất nhiều trở thành các plasmid đa năng và chuyên dụng. Hiện nay, các plasmid được sử dụng với 3 nhóm chính là:
Bảng 1.5. Các nhóm plasmid chính và đặc điểm của chúng
Nhóm plasmid Đặc điểm
pUC
Kích thước 2,6kb
Mang gen kháng kháng sinh ampicillin, chứa một phần gen lacZ’, có chưa polylinker cho phép chèn vào gần như bất kỳ DNA lạ.
pGEM
Có kích thước 3kb
Mang đầy đủ các trình tự của nhóm pUC và mang promotor đặc trưng cho RNA polymerase (SP6.T7).
pBluescript
Có kích thước 3kb
Là nhóm có ưu thế nhất, kết hợp được tất cả các ưu điểm của hai nhóm trên.
Chính vì nhóm plasmid pBluescript có nhiều ưu thế như vậy mà chúng tôi đã chọn plasmid pBluescrip II SK(+) là plasmid mang gen trong nghiên cứu này.
1.6.1. Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+)
Plasmid pBSIIK(+) có kích thước khoảng 3kb, plasmid này mang gen kháng kháng sinh ampicillin và vùng tạo dòng chứa các điểm cắt của các enzyme giới hạn: BamHI, KpnI, XbaI.
(Nguồn: GenBank Accession Number: X52328)
asd của chủng S. choleraesuis Smith nhằm tạo ra và nhân gen asd đột biến.
1.6.2. Plasmid pRE112
Để gen asd đã bị đột biến sau khi đưa vào S. choleraesuis có thể thực hiện quá trình thay thế gen asd của hệ gen trong tế bào, thì nó cần phải được đưa vào một plasmid tự hủy (sucide plasmid). Đây là plasmid chỉ có thế được nhân lên trong các tế bào E. coli mang gen pir sinh tổng hợp protein π có vai trò khởi động cho quá trình sao chép plasmid, do đó không thể tồn tại trong các tế bào vi khuẩn S. choleraesuis [15].
Vì vậy trước khi bị loại bỏ, plasmid này sẽ gắn đoạn gen của chúng mang vào hệ gen của vật chủ thông qua cơ chế trao đổi chéo, nhờ đó mà việc trao đổi gen được thực hiện thành công. Plasmid pRE112 là một trong các sucide plasmid có kích thước khoảng 5kb, mang gen kháng chloramphenicol (Cmr) và sacBI cho phép có thể nhận biết được sự tiếp nhận và loại bỏ của tế bào đối với plasmid này, nên đã được chúng tôi lựa chọn.
1.7. Tế bào chủ để khuếch đại gen
Có rất nhiều tế bào chủ dùng trong tạo dòng như E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, vi rút động vật, v.v..Trong đó E. coli thường được sử dụng là tế bào chủ phổ biến nhất do chúng có các đặc tính:
Dễ nuôi
Sinh sản nhanh
Không tiết enzyme, v.v..
E. coli dùng để tạo dòng đã được cải biến rất nhiều như: loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách gây đột biến hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh, hệ thống tái tổ hợp DNA được sửa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp, thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm tăng lượng plasmid tích lũy trong tế bào.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn chủng E. coli JM109 khả biến trong việc tạo dòng pBSIIK(+)/Δasd. Chủng E. coli χ7213 sử dụng trong việc tạo dòng plasmid pRE112/Δasd. Plasmid pRE112 là plasmid chỉ nhân lên trong tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E. coli có gen pir sinh tổng hợp protein π, có vai trò khởi động cho quá trình sao chép plasmid và E. coli χ7213 đáp ứng được yêu cầu .
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đối tượng: Vi khuẩn S. choleraesuis chủng Smith nhược độc đang được dùng để sản xuất vacxin phòng bệnh Phó thương hàn ở lợn tại Phân viện Thú y Miền Trung.
Địa điểm: Phân viện Thú y Miền Trung - Nha trang - Khánh hòa. Thời gian nghiên cứu: từ 20/2/2012 - 02/6/2012.
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu
2.2.1. Các chủng vi sinh vật
Vi khuẩn S. choleraesuis chủng Smith nhược độc ở dạng đông khô, đang được sử dụng để sản xuất vacxin phòng bệnh Phó thương hàn ở lợn, lưu trữ tại Phân Viện thú y Miền Trung.
Các chủng vi khuẩn E. coli χ7213, E. coli khả biến JM109 được cung cấp bởi công ty Promega.
Plasmid pRE112 được cung cấp từ Đại học Bang Arizona - Mỹ
Plasmid pBluescriptIISK(+) (pBSIIK+) cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học
Bảng 2.6. Các plasmid dùng trong nghiên cứu
Plasmid Kích thước Gen chọn lọc Nguồn cung cấp
pBluescriptIISK(+) 3 kp Cmr Promega
Suiscide plasmid
pRE112 5,173 kp SacB Promega
2.2.2. Hóa chất và môi trường
Các loại đường sử dụng để kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng đột biến như: glucose, sucrose, maltose, mannitol, lactose, arabinose, rhamnose, xylose, ...
Enzyme Taq, Pwo Polymerase, enzyme T4 ADN ligationase.
Các bộ kit dùng trong nghiên cứu: Blood &Tissue Extraction, QIAprep Spin Miniprep Kit, Purification Mini Kit
Bảng 2.7. Các bộ kit được dùng trong nghiên cứu
Bảng 2.8. Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR
Khuôn gen Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Kích
thước Ghi chú Pa1F TTTCTAGACGCTTTGAGCACGA CTAA XbaI Đoạn đầu asd (Pa12) Pa2R TTGGATCCTGCGTTAGGAAGG GAATC 2112 Bam HI Pa3F TTGGATCCAGGGTAGCTTAAT CCCAC Bam HI Đoạn cuối asd (Pa34) Pa4R TTGGTACCACCGAGCGTTCATT GTCA 2069 KpnI Pa5F TTGCTTTCCAACTGCTGAGC Asd/asd Pa6R TCCTATCTGCGTCGTCCTAC 1803/ 315 Pa7F F: TTGGACAATGTTACCGATAA Asd/asd Pa6R R: TCCTATCTGCGTCGTCCTAC 3717/ 2229
TT Tên bộ kit Thành phần bộ kit Mục đích Nguồn
1 Blood&Tissue Extraction Đệm ATL Đệm AL Đệm AW1 Đệm AW2 Đệm AE Ethanol 96% Proteinase K Tách chiết hệ gen 2 QIAprep Spin Miniprep Kit Đệm P1 Đệm P2 Đệm N3 Đệm PE Đệm EB Tách chiết plasmid 3 Purification Mini Kit Đệm QG Đệm PE Đệm EB Chiết tách, tinh sạch DNA từ gel Hãng QIAgen
Bảng 2.9. Các enzyme cắt giới hạn
TT Enzyme Nguồn Trình tự nhận biết
1 XbaI Xanthomonas badrii TCTAGA 2 BamHI Bacillus
amyloliquefaciens GGATCC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 KpnI Klebsiella
Pneumoniae OK8 GGTACC
Các loại môi trường được dùng như: LB broth, LB agar, NA, NB... Dung dịch đệm: phosphate buffer saline (PBS), SOC, TBE, …
Bảng 2.10. Bảng thành phần các môi trường nuôi cấy
Loại môi trường Thành phần
LB (Luria - Bertani) broth 25 (g/l)
LB agar 37 (g/l)
NA (Nutrient agar)
Casein (10g/l) Yeast extract (5g/l) Agar (18g/l)
NB (Nutrient broth) Casein (10g/l) Yeast extract (5g/l) SOC (cho 500ml) Tryptone (2%) Yeast (0.5%) NaCl (10mM) KCl (2,5mM) MgCl2 (10mM) MgSO4 (10mM) Glucose (20mM)
Ngoài ra còn sử dụng một số loại môi trường để chọn lọc những chủng mong muốn như LB có bổ sung DAP, môi trường bổ sung thêm sucrose 5%, chloramphenicol (Cm) 30µg/ml, DL-α,ε-Diaminopimelic acid (DAP) 50µg/ml, ampicillin 100 µg/ml, kanamycin (Km) 50 µg/ml, ethidium bromide.
2.2.3. Thiết bị chuyên dụng
Máy ly tâm - Hettich Máy ly tâm lạnh Z36HK Máy voltex - VWR
Máy luân nhiệt - Techne TC52 Hệ thống điện di ngang - Minigel XL Bộ đọc điện di - Vilber Lourmart Tủ ấm MIR - 262
Tủ ấm lắc - Hàn Quốc
Tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu - Nhật Lò vi sóng - Nhật
Tủ cấy vô trùng - ESCO Bể ổn nhiệt - Nhật
Cân phân tích - Swiitzerland Máy đo PH - Hàn Quốc
Máy đo quang phổ OD UV mini - 1240 Tủ sấy - Đức
Nồi hấp tiệt trùng - Nhật Máy khuấy từ …
2.3. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA tổng số theo protocol của bộ kit Blood &Tissue Extraction hãng QIAgen
với điều kiện nuôi cấy: 37ºC, lắc ở 200 vòng/phút.
Lấy 5 ml dịch vi khuẩn sau khi nuôi cấy qua đêm, đi ly tâm để thu sinh khối ở 5000 vòng/phút trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi.
Hoàn nguyên phần cặn trong 180 µl đệm ATL.
Thêm 20 µl proteinase K. Vortex đều rồi ủ ở 56ºC trong 1 giờ.
Sau khi ủ lấy ra vortex 15 giây. Thêm 200 µl đệm AL vào mẫu. Vortex đều rồi thêm 200 µl ethanol 96%, vortex.
Dùng pipet hút dịch mẫu trên cho vào cột DNeasy Mini spin được đặt trên tube 2 ml để thu dịch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ tube. Đặt cột vào tube thu dịch mới. Thêm 500 µl đệm AW1. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ tube. Đặt cột vào tube thu dịch mới. Thêm 500 µl đệm AW2. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ tube.
Đặt cột vào eppendorf vô trùng mới. Thêm 200 µl đệm AE vào giữa màng lọc. Để yên trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Loại bỏ cột, đậy nắp eppendorf, bảo quản ở - 20ºC.
2.3.2.. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
Tách chiết DNA plasmid theo protocol của bộ kit QIAprep spin Miniprep hãng QIAgen
Cách tiến hành:
Nuôi cấy qua đêm chủng vi khuẩn trong môi trường dịch thích hợp với điều kiện 37ºC, lắc 200 vòng/phút.
Lấy 5 ml dịch vi khuẩn sau khi nuôi cấy qua đêm đi ly tâm để thu sinh khối ở 5000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi.
Hoàn nguyên cặn trong 250 µl đệm P1 rồi chuyển toàn bộ qua eppendorf. Bổ sung 250 µl đệm P2, trộn đều bằng cách lật úp eppendorf 4-6 lần.
Bổ sung 350 µl đệm N3, lật úp eppendorf 4-6 lần. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển toàn bộ dịch sang cột QIAprep spin.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ nước trong cột. Thêm 750 µl đệm PE, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ nước trong cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt phần cột có màng lọc lên 1 eppendorf vô trùng mới.
Cho 50 µl đệm EB vào giữa màng lọc, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Loại bỏ cột, đậy nắp eppendorf, bảo quản ở -20ºC.
2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen
Cách tiến hành:
Sau khi điện di DNA trên gel, đặt gel dưới đèn UV, cắt lấy phần gel có chứa DNA rồi cho vào eppendorf 1,5 ml sạch.
Cân gel.
Cho đệm QG vào với thể tích gấp 3 lần khối lượng gel cân được.
Ủ trong bể ổn nhiệt với điều kiện nhiệt độ 50ºC trong 10 phút cho gel tan hết.
Dùng pipet hút dịch trên chuyển toàn bộ vào cột Quick Gel Extraction. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Giữ lại cột và loại bỏ dịch trong tube. Cho 500 µl QG vào giữa cột.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ dịch trong tube.
Cho thêm 750 µl đệm PE vào cột. Để yên trong 4 phút.
Sau đó đem đi ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch trong tube.
Loại bỏ tube.
Đặt cột vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng mới.
Cuối cùng cho thêm 40 µl EB vào giữa màng lọc trên cột. Để yên 1 phút tại nhiệt độ phòng.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, đậy nắp eppendorf ta thu được DNA cần tinh sạch, Đem đi bảo quản ở -20ºC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.4. Phương pháp PCR
Nhân đoạn gen asd bằng phản ứng PCR theo phương pháp của Kang và cộng
sự [12]
Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (50µl) thể hiện ở Bảng 2.11
Bảng 2.11. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 37 2 10X buffer 5 3 dNTP 1 4 Cặp mồi 2,5
5 PFU - Pwo Polymerse 1
6 DNA khuôn 1
Thực hiện phản ứng PCR trong máy luân nhiệt theo chu trình nhiệt được thể hiện ở Bảng 2.12
Bảng 2.12. Bảng chu trình nhiệt (Thời gian: phút)
Các bước Khởi động Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Gữ mẫu
Nhiệt độ (0C) 95 95 56 72 72 4
Thời gian 1 0,5 0,5 2,5 10 ∞
Chạy điện di sản phẩm trên máy điện di ngang, gel agarose 1,2 %, với dòng điện 1 chiều ở 126 volt trong 30 - 40 phút.
Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid bằng phản ứng PCR theo phương pháp của Vu - Khac H và Kurt Miller [20]
Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (25µl) thể hiện ở Bảng 2.13
Bảng 2.13. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Master mix 12,5 2 Cặp mồi 0.5 3 H2O 11 4 DNA khuôn 0.5
Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình nhiệt thể hiện ở Bảng 2.14
Bảng 2.14. Bảng chu trình nhiệt
Các bước Khởi động Biến tính Gắn mồi Kéo dài ổn định Gữ mẫu
Nhiệt độ
(0C) 95 95 48,5 72 72 4
Thời gian
(Phút) 3 0,5 2,5 3 10 ∞
Số chu kỳ 1 30 1
Chạy điện di sản phẩm trên bộ điện di ngang, gel agarose 0,8%, với dòng điện một chiều ở 126 volt trong 30 - 40 phút.
Vu - Khac H và Kurt Miller [20]
Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (25µl) thể hiện ở Bảng 2.15.
Bảng 2.15. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Master mix 12,5 2 Cặp mồi 0.5 3 H2O 10,5 4 DNA khuôn 1
Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình nhiệt thể hiện ở Bảng 2.16
Bảng 2.16. Bảng chu trình nhiệt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các bước Khởi
động Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định
Giữ mẫu Nhiệt độ (0C) 95 95 50 72 72 4 Thời gian (phút) 3 0,5 0,5 2,5 10 ∞ Số chu kỳ 1 30 1
Chạy điện di sản phẩm trên bộ điện di ngang, gel agarose 1.2 %, với dòng điện một chiều ở 126 volt trong 30 - 40 phút.
Phản ứng Colony PCR
PCR kiểm tra lại vi khuẩn S. choleraesuis sử dụng khuẩn lạc
Bảng 2.17. Thành phần cho một mẫu phản ứng Colony PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Master mix 12,5 2 Cặp mồi 1.5 3 H2O 7 4 Colony 2,5
Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình thể hiện ở Bảng 2.18.
Bảng 2.18. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Colony
Các bước Khởi động
Biến
tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu
Nhiệt độ (oC) 95 95 50 72 72 4
Thời gian
(phút) 5 0,5 1 3 10 ∞
Số chu kỳ 1 30 1
Chạy điện di sản phẩm trên bộ điện di ngang, agarose 1,2% với dòng điện 1 chiều ở 126 volt trong 30 - 40 phút
Phản ứng phân cắt sản phẩm PCR, plasmid và lai của Vu - Khac H và Kurt Miller [20]
+ Phân cắt sản phẩm PCR: sản phẩm PCR sau khi tinh sạch từ gel được cắt
bằng enzyme cắt giới hạn.
Bảng 2.19. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) 1 NEB buffer II 11 2 Sản phẩm PCR 5 3 Enzyme cắt giới hạn 2,5 4 H2O 34
Ủ ở 370C trong 4 giờ, tiếp theo kiểm tra sự phân cắt bằng điện di. Sau đó tinh sạch sản phẩm bằng bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen để thực hiện phản ứng lai tiếp theo.
+ Phân cắt Plasmid: plasmid sau khi chiết tách, kiểm tra bằng điện di được
cắt bằng enzyme cắt giớ hạn và xử lý với CIP.
Bảng 2.20. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) 1 NEB buffer II 10 2 Enzyme cắt giới hạn 2,5 3 Plasmid 8 4 H2O 67
Ủ ở 370C trong 4 giờ, tiếp theo thêm 1,5 µl CIP ủ tiếp trong 3 giờ . Sau đó điện di kiểm tra sản phẩm phân cắt, tinh sạch sản phẩm phân cắt bằng bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen.
Bảng 2.21. Thành phần phản ứng lai STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Plasmid 6 2 DNA 3 3 T4 ligation buffer 1,5 4 H2O 3 5 T4 DNA 1,5 Ủ 160C qua đêm.
2.3.5. Phương pháp biến nạp của Kang và cs
Nguyên vật liệu:
Bảng 2.22. Nguyên vật liệu dùng trong phương pháp biến nạp của Kang và cs (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thành phần nguyên liệu Chú thích
Dung dịch SOC
LB + Amp (100 µg/ml) Đối với E. coli JM109