Đoạn gen Pa12 và vector pBSIIK(+) được xử lý bằng enzyme giới hạn
BamHI và XbaI, sau đó được tinh sạch qua cột QIAgen và dùng cho phản ứng lai ghép. Sản phẩm của phản ứng lai ghép được biến nạp vào tế bào E. coli JM109 và sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh Ampicillin.
Các thể biến nạp mọc trên môi trường chọn lọc được nuôi cấy qua đêm, tách chiết plasmid và cắt với enzyme giới hạn để kiểm tra sự có mặt của plasmid pBSIIK(+)/Pa12 trong tế bào.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 2 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/ Pa12, bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và XbaI trên gel agarose 1,2% được trình bày trên Hình 3.12
pBSIIK+
Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 2 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Pa12
Phổ điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid của các thể biến nạp bằng enzyme giới hạn có hai band tương đương với kích thước của plasmid pBSIIK(+) (3 kp) và Pa12 (2 kp). Điều này cho thấy chúng chúng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Pa12.
Dòng E. coli mang pBSIIK(+)/Pa12 được sử dụng để tách chiết plasmid làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen Pa12 và Pa34.
Plasmid pBSIIK(+)/Pa12 và đoạn gen Pa34 sau khi xử lý với enzyme cắt giới hạn BamHI và KpnI, được ủ lại qua đêm ở 160C. Sản phẩm lai sau đó được biến nạp vào tế bào E. coli JM109 và sàng lọc trên môi trường LB có Ampicillin. Plasmid của các thể biến nạp có khả năng sinh trưởng trên môi trường chọn lọc được tách chiết và cắt kiểm tra với enzyme giới hạn BamHI và KpnI. Kết quả điện di cho thấy plasmid tái tổ hợp pBSIIK(+)/Pa12/Pa34 hay pBSIIK(+)/Δasd đã được tạo thành công.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd bằng cặp enzyme BamHI và KpnI trên gel agarose 1,2% được trình bày trên Hình 3.13
1 2 3 4 5 6
pBSIIK+/Pa12
Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd
Phổ điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid của các thể biến nạp bằng enzyme giới hạn có hai band tương đương với kích thước của plasmid pBSIIK(+)/Pa12 (4 kp) và Pa34 (2 kp). Điều này cho thấy chúng chúng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd.