- Xác định trình tự nucleotide
3.3.2.Kết quả xác định trình tự nucleotide vùng gen ITS, psbA-trnH và trnL-
trnF của loài Thông lá dẹt
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm DNA khuôn cho xác định trình tự nucleotide. Quá trình xác định trình tự được gửi sang công ty Macrogen (Hàn Quốc). Phản ứng đọc trình tự được thực hiện theo cả hai chiều xuôi và ngược.
Cả bốn mẫu Thông lá dẹt phân tích với ba cặp mồi đặc hiệu đều thu được trình tự nucleotide có độ dài là 421 nucleotide đối với vùng gen trnL - trnF, 541 nucleotide đối với vùng gen psbA - trnH và 1090 nucleotide đối với vùng gen ITS.
Tất cả các trình tự DNA đích đều được giải mã thành công. Các peak (đỉnh) huỳnh quang thu được rất rõ ràng, tương ứng với từng loại nucleotide cụ thể. Điều này cho thấy kết quả xác định trình tự có độ tin cậy cao, giảm thiểu các sai sót giữa trình tự nucleotide thu được với trình tự thực tế. (Sai lệch giữa trình tự thu được từ kết quả thí nghiệm với trình tự thực tế vẫn có thể xảy ra do sự tổng hợp nhầm của enzyme Taq Polymerase trong phản ứng chuỗi và phản ứng đọc trình tự. Tuy nhiên
M 1a 2a 3a 4a 1b 2b 3b 4b 1c 2c 3c 4c
1000bp 750bp 500bp 250bp
sác xuất xẩy ra sai sót này là rất nhỏ khoảng 10-4, tức là cứ 10000 nucleotide thì sai 1 nucleotide).
Hình 3.10. Kết quả xác định trình tự nucleotide
Kết quả xác định trình tự vùng gen ITS
Thông qua ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (hình 3.10) cho thấy kết quả xác định trình tự vùng gen ITS có độ tin cậy rất cao. Các trình tự thu được của 04 mẫu nghiên cứu được xử lý phân tích bởi phần mềm BioEdit 4.0 (hình 3.11). Sau khi loại bỏ trình tự của đoạn mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng tôi đã thu được trình tự nucleotide có độ dài là 1090 nucleotide. Kết quả thống kê ở hình 3.11 đã chỉ ra 3 vị trí (1, 9 và 970) bị đột biến bởi việc chèn vào hay mất đi nucleotide khi so sánh giữa bốn mẫu nghiên cứu. Khi so sánh mẫu Pk45 thu tại Đắc Lắc với 3 mẫu thu tại Lâm Đồng (Pk5, Pk8 và Pk18) thì tại vị trí nucleotide thứ 1 (G) được thay bằng (C). Hay tại vị trí 9 và 970 (GG) được thay bằng (CT).
10 20 30 40 50
Pk5 GGGGCCCCGG ATCTTTGGGG GATTGTTTGG CGATACGATC AGGAACAGAT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 C...C. ... ... ... ...
60 70 80 90 100
Pk5 CAACAATATT TCACTCGGTA TTATCGACCT GGTCTATCCC GCACACTGGC
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ... 110 120 130 140 150
Pk5 AGCCATACAT TGCTCAGGAT CTCGGTCAAC AAACCGATAT CGATATCTAT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
160 170 180 190 200
Pk5 CTCGACCGCC ATGTAGTGCG TCAGGGACGA TATCTTTCGC TGCATGATGA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
210 220 230 240 250
Pk5 AGTAAAAAAC TTTCCGTTAC AGCACTGGCT GCGCAGTACG ATTATCGCTG
Pk8 ... ... ... ... ... (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
260 270 280 290 300
Pk5 CGGGCTCGCT GCTGGTGCTG TTTATGCTGT TATTCTGGAT CCCGCTGGAT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
310 320 330 340 350
Pk5 ATGCCGCTGA AATTCACTCT CTCATGGATG AAAGGCGCGC AGACCATTGA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
360 370 380 390 400
Pk5 AGCCACCAGC GTAAAACAAC TGGCTGACGC TGGCGTGCGG GTAGGCGATA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
410 420 430 440 450
Pk5 CATTGCGTAT TAGCGGTACG GGAATGTGTA ATATTCGAAC TTCCGGAACC
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
460 470 480 490 500
Pk5 TGGAGCGCGA AAACCAATTC ACCTTTTTTA CCGTTTGACT GCTCGCAGAT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
510 520 530 540 550
Pk5 CATCTGGAAC GACGCCCGCT CATTGCCATT ACCAGAATCT GAACTGGTCA
Pk18 ... ... ... ... ... (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk45 ... ... ... ... ...
560 570 580 590 600
Pk5 ACAAAGCGAC GGCATTGACT GAAGCAGTTA ATCGCCAGCT GCACCCTAAA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
610 620 630 640 650
Pk5 CCGGAAGATG AATCTCGCGT CAGTGCCTCA TTACGTTCAG CAATTCAAAA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
660 670 680 690 700
Pk5 ATCCGGCATG GTATTGCTTG ATGATTTTGG CGACATTGTA CTGAAGACAG
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
710 720 730 740 750
Pk5 CGGATTTATG TTCTGCCAAA GATGACTGTG TGCGACTGAA AAATGCGCTG
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
760 770 780 790 800
Pk5 GTCAATCTCG GCAACAGTAA AGACTGGGAC GCGCTGGTAA AACGCGCCAA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
810 820 830 840 850
Pk5 CGCCGGGAAG CTCGATGGCG TGAATGTGTT ATTACGCCCG GTGAGTGCGG
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ... (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk45 ... ... ... ... ...
860 870 880 890 900
Pk5 AATCGCTGGA TAACCTGGTG GCAACCTCCA CCGCGCCGTT TATCACGCAT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
910 920 930 940 950
Pk5 GAAACGGCGC GAGCGGCACA ATCACTAAAC AGTCCGGCCC CCGGCGGATT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
960 970 980 990 1000
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ...T ... ... ...
1010 1020 1030 1040 1050
Pk5 CGGCATCACT TACACACCCC CTTAAATTAT ATAAAAACAG AAAAAAAGGG
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
1060 1070 1080 1090
Pk5 GGGGGCCCAG GAGAAGGCCC GAAAGCGGCG AAAAAAACGC
Pk8 ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ...
Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen ITS xác định từ 4 mẫu
nghiên cứu thuộc loài Thông lá dẹt (Pk5: mẫu thu tại Yang Ly, Lâm Đồng; Pk8: mẫu thu tại Cổng Trời, Lâm Đồng; Pk18: mẫu thu tại Hòn Giao, Lâm Đồng; Pk45: mẫu thu tại Chư Yang Sin, Đắc Lắc).
A - trnH
Trình tự vùng psbA - trnH đã thu được chiều dài 541 nucleotide đối với bốn mẫu nghiên cứu. Sự khác nhau giữa các vị trí nucleotide khi so sánh giữa bốn mẫu nghiên cứu trong hình 3.12 đã chỉ ra 4 vị trí (38, 101, 258 và 375) đột biến bởi chèn vào hay mất đi nucleotide. So sánh ba mẫu (Pk5, Pk8 và Pk18) với mẫu Pk45 chỉ ra 3 vị trí sai khác nucleotide (38, 258 và 375) (CCG, tương ứng) được thay bằng (TGT, tương ứng). Hay tại vị trí 101 (G) được thay bằng (C) khi so sánh mẫu Pk5, Pk45 với mẫu Pk8 và Pk18.
10 20 30 40 50 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk5 GACAATGATA AACCATGTGC GCAGATGTTA TCGCGAACAA TTAGGCGCGA
Pk8 ... ... ... ...T.. ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ...T.. ...
60 70 80 90 100
Pk5 TAATACTCTG ATGGATTGTT ATCGTGTATT GCTTAATTGA AGCATCCCAA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
110 120 130 140 150
Pk5 CCCTTTCCAT CCCCCCAAAG GGCTGGTATG CTTCAGTTGT TTGTTGTTAT
Pk8 G... ... ... ... ...
Pk18 G... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
160 170 180 190 200
Pk5 TCTTCATACT TCTTCCCCCA TTCCTTCAAT AATGGATATG TGCAGTTCCC
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
210 220 230 240 250
Pk5 CTGCATCCAG CAGGAATTGA ACCCGCGAGT TCGCCAATTA TGAGTTGGGC
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
260 270 280 290 300
Pk5 GCTTTAAGCA ATCAGCCATG GATGCTGGAT TATGATCATC AACATATTCA
Pk8 ...C.. ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ...C.. ... ... ... ...
310 320 330 340 350 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk5 TTAGACATTC AAATAAAATT TCATTGAATG AATTTGATAA TAAGCCGAAC
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
360 370 380 390 400
Pk5 AACTTGTTCG AGAGTTGGGA GTTAGTCATC GATCTTGCTT TGATCCCCTA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ....T... ... ...
Pk45 ... ... ....T... ... ...
410 420 430 440 450
Pk5 TCAGAGTCAC CGACCCACAT ATGAACAAAC GTTAGCTCGT TTTTTCTTCT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
460 470 480 490 500
Pk5 TGGGAGAAAT ACACTGTAGA TATATAAATT GGGAGTGATC ACACACGGGC
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ... 510 520 530 540
Pk5 GGACATGATC AAGAGGAAAA GGGGGAGCAT TGCGATCACG C
Pk8 ... ... ... ... .
Pk18 ... ... ... ... .
Pk45 ... ... ... ... .
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen psbA - trnH xác định từ 4 mẫu
nghiên cứu thuộc loài Thông lá dẹt (Pk5: mẫu thu tại Yang Ly, Lâm Đồng; Pk8: mẫu thu tại Cổng Trời, Lâm Đồng; Pk18: mẫu thu tại Hòn Giao, Lâm Đồng; Pk45: mẫu thu tại Chư Yang Sin, Đắc Lắc).
L-trnF
Trình tự gen trnL - trnF thu được đoạn nucleotide có độ dài 421 nucleotide đối với bốn mẫu nghiên cứu. Đối với vùng gen trnL - trnF đã không chỉ ra vị trí đột biến nucleotide nào khi so sánh giữa 4 mẫu nghiên cứu với nhau (hình 3.13).
10 20 30 40 50
Pk5 GAACTACTGT CACTTGATTT CGCGCGTATT TGACTGGTGA CACGAGTTCA
Pk8 ... ... ... ... ... (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
60 70 80 90 100
Pk5 ACTCGTCTAC CTCTTGTCCA TTTCGTGTGT ATTTGTATGA TGGAAAAAGT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
110 120 130 140 150
Pk5 CTTTTTCCCA GTTTTTACAA TGATCTTTAT TATTTTCGAT CTGGAAGTCA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
160 170 180 190 200
Pk5 CTAATATGAG AAAAAATGGA CTGCAATTGA ATAATTTCAA ATGATCTAAT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
210 220 230 240 250
Pk5 CTATGTAGAT CATATATCAC AAAATCAATT GATCATATGA TCAATTGATT
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
260 270 280 290 300
Pk5 AACGGATCAA CTCAACTTGT CATAAGATGG ATGAAAAGAT TCATGTTCTA
Pk8 ... ... ... ... ...
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
310 320 330 340 350
Pk5 ATTTCTTCTC ATCATGAAAA AAAAAACAAT TGAGCAAACA GAAACATTAG
Pk8 ... ... ... ... ... (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pk18 ... ... ... ... ...
Pk45 ... ... ... ... ...
360 370 380 390 400
Pk5 AAAAAGTAAG AGGGATTTAA ACCATGGGAA ATAGATCATT CCGTTGGGAA
Pk8 ... ... ... ... ... Pk18 ... ... ... ... ... Pk45 ... ... ... ... ... 410 420 Pk5 ACGACCTTGG GGGGGAAAAA A Pk8 ... ... . Pk18 ... ... . Pk45 ... ... .
Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen trnL - trnF xác định từ 4
mẫu nghiên cứu thuộc loài Thông lá dẹt (Pk5: mẫu thu tại Yang Ly, Lâm Đồng; Pk8: mẫu thu tại Cổng Trời, Lâm Đồng; Pk18: mẫu thu tại Hòn Giao, Lâm Đồng; Pk45: mẫu thu tại Chư Yang Sin, Đắc Lắc).