Kết quả xác định trình tự nucleotide vùng gen ITS, psbA-trnH và trnL-

Một phần của tài liệu Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền quần thể thông lá dẹt (pinus krempfii lecomte) ở tây nguyên loài đặc hữu của việt nam (Trang 41)

- Xác định trình tự nucleotide

3.3.2. Kết quả xác định trình tự nucleotide vùng gen ITS, psbA-trnH và trnL-

trnF của loài Thông lá dẹt

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm DNA khuôn cho xác định trình tự nucleotide. Quá trình xác định trình tự được gửi sang công ty Macrogen (Hàn Quốc). Phản ứng đọc trình tự được thực hiện theo cả hai chiều xuôi và ngược.

Cả bốn mẫu Thông lá dẹt phân tích với ba cặp mồi đặc hiệu đều thu được trình tự nucleotide có độ dài là 421 nucleotide đối với vùng gen trnL - trnF, 541 nucleotide đối với vùng gen psbA - trnH và 1090 nucleotide đối với vùng gen ITS.

Tất cả các trình tự DNA đích đều được giải mã thành công. Các peak (đỉnh) huỳnh quang thu được rất rõ ràng, tương ứng với từng loại nucleotide cụ thể. Điều này cho thấy kết quả xác định trình tự có độ tin cậy cao, giảm thiểu các sai sót giữa trình tự nucleotide thu được với trình tự thực tế. (Sai lệch giữa trình tự thu được từ kết quả thí nghiệm với trình tự thực tế vẫn có thể xảy ra do sự tổng hợp nhầm của enzyme Taq Polymerase trong phản ứng chuỗi và phản ứng đọc trình tự. Tuy nhiên

M 1a 2a 3a 4a 1b 2b 3b 4b 1c 2c 3c 4c

1000bp 750bp 500bp 250bp

sác xuất xẩy ra sai sót này là rất nhỏ khoảng 10-4, tức là cứ 10000 nucleotide thì sai 1 nucleotide).

Hình 3.10. Kết quả xác định trình tự nucleotide

Kết quả xác định trình tự vùng gen ITS

Thông qua ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (hình 3.10) cho thấy kết quả xác định trình tự vùng gen ITS có độ tin cậy rất cao. Các trình tự thu được của 04 mẫu nghiên cứu được xử lý phân tích bởi phần mềm BioEdit 4.0 (hình 3.11). Sau khi loại bỏ trình tự của đoạn mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng tôi đã thu được trình tự nucleotide có độ dài là 1090 nucleotide. Kết quả thống kê ở hình 3.11 đã chỉ ra 3 vị trí (1, 9 và 970) bị đột biến bởi việc chèn vào hay mất đi nucleotide khi so sánh giữa bốn mẫu nghiên cứu. Khi so sánh mẫu Pk45 thu tại Đắc Lắc với 3 mẫu thu tại Lâm Đồng (Pk5, Pk8 và Pk18) thì tại vị trí nucleotide thứ 1 (G) được thay bằng (C). Hay tại vị trí 9 và 970 (GG) được thay bằng (CT).

10 20 30 40 50

Pk5 GGGGCCCCGG ATCTTTGGGG GATTGTTTGG CGATACGATC AGGAACAGAT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 C...C. ... ... ... ...

60 70 80 90 100

Pk5 CAACAATATT TCACTCGGTA TTATCGACCT GGTCTATCCC GCACACTGGC

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ... 110 120 130 140 150

Pk5 AGCCATACAT TGCTCAGGAT CTCGGTCAAC AAACCGATAT CGATATCTAT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

160 170 180 190 200

Pk5 CTCGACCGCC ATGTAGTGCG TCAGGGACGA TATCTTTCGC TGCATGATGA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

210 220 230 240 250

Pk5 AGTAAAAAAC TTTCCGTTAC AGCACTGGCT GCGCAGTACG ATTATCGCTG

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

260 270 280 290 300

Pk5 CGGGCTCGCT GCTGGTGCTG TTTATGCTGT TATTCTGGAT CCCGCTGGAT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

310 320 330 340 350

Pk5 ATGCCGCTGA AATTCACTCT CTCATGGATG AAAGGCGCGC AGACCATTGA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

360 370 380 390 400

Pk5 AGCCACCAGC GTAAAACAAC TGGCTGACGC TGGCGTGCGG GTAGGCGATA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

410 420 430 440 450

Pk5 CATTGCGTAT TAGCGGTACG GGAATGTGTA ATATTCGAAC TTCCGGAACC

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

460 470 480 490 500

Pk5 TGGAGCGCGA AAACCAATTC ACCTTTTTTA CCGTTTGACT GCTCGCAGAT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

510 520 530 540 550

Pk5 CATCTGGAAC GACGCCCGCT CATTGCCATT ACCAGAATCT GAACTGGTCA

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

560 570 580 590 600

Pk5 ACAAAGCGAC GGCATTGACT GAAGCAGTTA ATCGCCAGCT GCACCCTAAA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

610 620 630 640 650

Pk5 CCGGAAGATG AATCTCGCGT CAGTGCCTCA TTACGTTCAG CAATTCAAAA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

660 670 680 690 700

Pk5 ATCCGGCATG GTATTGCTTG ATGATTTTGG CGACATTGTA CTGAAGACAG

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

710 720 730 740 750

Pk5 CGGATTTATG TTCTGCCAAA GATGACTGTG TGCGACTGAA AAATGCGCTG

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

760 770 780 790 800

Pk5 GTCAATCTCG GCAACAGTAA AGACTGGGAC GCGCTGGTAA AACGCGCCAA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

810 820 830 840 850

Pk5 CGCCGGGAAG CTCGATGGCG TGAATGTGTT ATTACGCCCG GTGAGTGCGG

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

860 870 880 890 900

Pk5 AATCGCTGGA TAACCTGGTG GCAACCTCCA CCGCGCCGTT TATCACGCAT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

910 920 930 940 950

Pk5 GAAACGGCGC GAGCGGCACA ATCACTAAAC AGTCCGGCCC CCGGCGGATT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

960 970 980 990 1000

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ...T ... ... ...

1010 1020 1030 1040 1050

Pk5 CGGCATCACT TACACACCCC CTTAAATTAT ATAAAAACAG AAAAAAAGGG

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

1060 1070 1080 1090

Pk5 GGGGGCCCAG GAGAAGGCCC GAAAGCGGCG AAAAAAACGC

Pk8 ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ...

Hình 3.11. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen ITS xác định từ 4 mẫu

nghiên cứu thuộc loài Thông lá dẹt (Pk5: mẫu thu tại Yang Ly, Lâm Đồng; Pk8: mẫu thu tại Cổng Trời, Lâm Đồng; Pk18: mẫu thu tại Hòn Giao, Lâm Đồng; Pk45: mẫu thu tại Chư Yang Sin, Đắc Lắc).

A - trnH

Trình tự vùng psbA - trnH đã thu được chiều dài 541 nucleotide đối với bốn mẫu nghiên cứu. Sự khác nhau giữa các vị trí nucleotide khi so sánh giữa bốn mẫu nghiên cứu trong hình 3.12 đã chỉ ra 4 vị trí (38, 101, 258 và 375) đột biến bởi chèn vào hay mất đi nucleotide. So sánh ba mẫu (Pk5, Pk8 và Pk18) với mẫu Pk45 chỉ ra 3 vị trí sai khác nucleotide (38, 258 và 375) (CCG, tương ứng) được thay bằng (TGT, tương ứng). Hay tại vị trí 101 (G) được thay bằng (C) khi so sánh mẫu Pk5, Pk45 với mẫu Pk8 và Pk18.

10 20 30 40 50

Pk5 GACAATGATA AACCATGTGC GCAGATGTTA TCGCGAACAA TTAGGCGCGA

Pk8 ... ... ... ...T.. ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ...T.. ...

60 70 80 90 100

Pk5 TAATACTCTG ATGGATTGTT ATCGTGTATT GCTTAATTGA AGCATCCCAA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

110 120 130 140 150

Pk5 CCCTTTCCAT CCCCCCAAAG GGCTGGTATG CTTCAGTTGT TTGTTGTTAT

Pk8 G... ... ... ... ...

Pk18 G... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

160 170 180 190 200

Pk5 TCTTCATACT TCTTCCCCCA TTCCTTCAAT AATGGATATG TGCAGTTCCC

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

210 220 230 240 250

Pk5 CTGCATCCAG CAGGAATTGA ACCCGCGAGT TCGCCAATTA TGAGTTGGGC

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

260 270 280 290 300

Pk5 GCTTTAAGCA ATCAGCCATG GATGCTGGAT TATGATCATC AACATATTCA

Pk8 ...C.. ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ...C.. ... ... ... ...

310 320 330 340 350

Pk5 TTAGACATTC AAATAAAATT TCATTGAATG AATTTGATAA TAAGCCGAAC

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

360 370 380 390 400

Pk5 AACTTGTTCG AGAGTTGGGA GTTAGTCATC GATCTTGCTT TGATCCCCTA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ....T... ... ...

Pk45 ... ... ....T... ... ...

410 420 430 440 450

Pk5 TCAGAGTCAC CGACCCACAT ATGAACAAAC GTTAGCTCGT TTTTTCTTCT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

460 470 480 490 500

Pk5 TGGGAGAAAT ACACTGTAGA TATATAAATT GGGAGTGATC ACACACGGGC

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ... 510 520 530 540

Pk5 GGACATGATC AAGAGGAAAA GGGGGAGCAT TGCGATCACG C

Pk8 ... ... ... ... .

Pk18 ... ... ... ... .

Pk45 ... ... ... ... .

Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen psbA - trnH xác định từ 4 mẫu

nghiên cứu thuộc loài Thông lá dẹt (Pk5: mẫu thu tại Yang Ly, Lâm Đồng; Pk8: mẫu thu tại Cổng Trời, Lâm Đồng; Pk18: mẫu thu tại Hòn Giao, Lâm Đồng; Pk45: mẫu thu tại Chư Yang Sin, Đắc Lắc).

L-trnF

Trình tự gen trnL - trnF thu được đoạn nucleotide có độ dài 421 nucleotide đối với bốn mẫu nghiên cứu. Đối với vùng gen trnL - trnF đã không chỉ ra vị trí đột biến nucleotide nào khi so sánh giữa 4 mẫu nghiên cứu với nhau (hình 3.13).

10 20 30 40 50

Pk5 GAACTACTGT CACTTGATTT CGCGCGTATT TGACTGGTGA CACGAGTTCA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

60 70 80 90 100

Pk5 ACTCGTCTAC CTCTTGTCCA TTTCGTGTGT ATTTGTATGA TGGAAAAAGT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

110 120 130 140 150

Pk5 CTTTTTCCCA GTTTTTACAA TGATCTTTAT TATTTTCGAT CTGGAAGTCA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

160 170 180 190 200

Pk5 CTAATATGAG AAAAAATGGA CTGCAATTGA ATAATTTCAA ATGATCTAAT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

210 220 230 240 250

Pk5 CTATGTAGAT CATATATCAC AAAATCAATT GATCATATGA TCAATTGATT

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

260 270 280 290 300

Pk5 AACGGATCAA CTCAACTTGT CATAAGATGG ATGAAAAGAT TCATGTTCTA

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

310 320 330 340 350

Pk5 ATTTCTTCTC ATCATGAAAA AAAAAACAAT TGAGCAAACA GAAACATTAG

Pk8 ... ... ... ... ...

Pk18 ... ... ... ... ...

Pk45 ... ... ... ... ...

360 370 380 390 400

Pk5 AAAAAGTAAG AGGGATTTAA ACCATGGGAA ATAGATCATT CCGTTGGGAA

Pk8 ... ... ... ... ... Pk18 ... ... ... ... ... Pk45 ... ... ... ... ... 410 420 Pk5 ACGACCTTGG GGGGGAAAAA A Pk8 ... ... . Pk18 ... ... . Pk45 ... ... .

Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen trnL - trnF xác định từ 4

mẫu nghiên cứu thuộc loài Thông lá dẹt (Pk5: mẫu thu tại Yang Ly, Lâm Đồng; Pk8: mẫu thu tại Cổng Trời, Lâm Đồng; Pk18: mẫu thu tại Hòn Giao, Lâm Đồng; Pk45: mẫu thu tại Chư Yang Sin, Đắc Lắc).

Một phần của tài liệu Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền quần thể thông lá dẹt (pinus krempfii lecomte) ở tây nguyên loài đặc hữu của việt nam (Trang 41)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(71 trang)