- Xác định trình tự nucleotide
3.2.2. Tính đa dạng di truyền quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị SSR Tính đa hình DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt
Tính đa hình DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt
Mười bảy cặp mồi SSR đã được sử dụng để phân tích cho 70 cá thể thuộc 4 quần thể Thông lá dẹt thu tại Yang Ly, Cổng Trời, Hòn Giao (Lâm Đồng) và Chư Yang Sin (Đắc Lắc) thì có 8/17 cặp mồi có tính đa hình với số alen dao động từ 2 (cặp mồi Pt36480 và Pt9383) đến 6 (cặp mồi PRE24, PtTX3020). Chín cặp mồi còn lại không chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu, mỗi cặp mồi đều phát hiện được 1 alen. Với 17 cặp mồi SSR đã phát hiện được tổng số 42 alen, trong đó 32 alen đa hình (chiếm 76,19 %). Số alen phát hiện được ở mỗi quần thể khác nhau, dao động từ 30 alen (quần thể Yang Ly) đến 36 alen (quần thể Chư Yang Sin) (Số liệu không chỉ ra ở đây). Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Thông lá dẹt (hình 3.4) với cặp mồi Pt30204 đại diện cho 17 cặp mồi SSR nghiên cứu.
Cặp mồi Pt30204: Kết quả điện di sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Thông lá
dẹt với cặp mồi Pt30204 được thể hiện trong hình 3.4. Tổng số 4 phân đoạn DNA nhân bản được thì cả 4 phân đoạn đa hình (chiếm tỷ lệ 100 %). Đây là một trong hai cặp mồi có 100 % phân đoạn đa hình. Các phân đoạn DNA nhân bản được có kích thước dao động từ 120 đến 205 bp. Sự đa hình DNA giữa các mẫu Thông lá dẹt được thể hiện tương đối rõ khi phân tích với cặp mồi Pt30204, ở vị trí 120 bp (hình →) có 5 mẫu Pk7, Pk30, Pk43, Pk44 và Pk45 (tương ứng các giếng số 7, 30, 43, 44 và 45) xuất hiện phân đoạn DNA, 65 mẫu còn lại đều không xuất hiện phân đoạn
DNA. Hay tại vị ví 160 bp (hình ←) tất cả các mẫu đều xuất hiện phân đoạn DNA trừ các mẫu Pk14, Pk17, Pk24, Pk25, Pk26, pk54 và Pk59 (tương ứng các giếng số 14, 17, 24, 25, 26, 54 và 59). Như vậy kết quả phân tích với cặp mồi Pt30204 đã chỉ ra sự đa dạng DNA giữa 70 mẫu Thông lá dẹt nghiên cứu.
Hình 3.4. Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Thông lá dẹt phân tích với cặp mồi
Pt30204 trên gel poly acrylamide 5% (giếng 1-70 thứ tự của các mẫu Thông lá dẹt như trong bảng 1, M: marker phân tử 100bp).
Đa dạng di truyền của 4 quần thể Thông lá dẹt
Đa dạng di truyền trong bốn quần thể Thông lá dẹt với chỉ thị SSR được chỉ ra ở bảng 3.5. Giá trị alen quan sát trung bình (Na) thay đổi từ 1,765 (quần thể Yang Ly) đến 2,118 (quần thể Chư Yang Sin) với giá trị trung bình của 4 quần thể là 1,912. Số alen hiệu quả (Ne) dao động từ 1,455 (quần thể Hòn Giao) đến 1,667 (quần thể Cổng Trời) với giá trị trung bình là 1,529.
Số alen hiếm trên một locus (Ap) chỉ tìm thấy ở ba quần thể Yang Ly (0,059), Cổng Trời (0,118) và quần thể Chư Yang Sin (0,294). Cụ thể đã tìm thấy alen hiếm ở lô cút RPE24 và PRS2 tại Cổng Trời; locus PtTX3020 tại Yang Ly; locus PtTX3020, PtTX3026, Pt26081 và PRS2 tại Chư Yang Sin. Không tìm thấy alen hiếm tại quần thể Hòn Giao.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 30 31 32 33 34 35 3637 3839 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70200 bp 200 bp 100 bp 300 bp 400 bp 500 bp
Giá trị của hệ số gen dị hợp tử quan sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể, trung bình 0,303 dao động từ 0,271 ở quần thể Yang Ly đến 0,332 ở quần thể Chư Yang Sin. Trong khi đó giá trị hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) dao động từ 0,200 ở quần thể Hòn Giao đến 0,250 ở quần thể Cổng Trời. Giá trị Ho và He cao được tìm thấy ở mức độ loài, với giá trị 0,310 và 0,234, tương ứng. Kiểm định cân bằng Hardy-Weinberg đã chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa giữa hệ số gen dị hợp tử quan sát và mong đợi tại locus PRE24, PtTX3020, Pt9383, Pt26081, Pt30204, RPS2 và Pt71936 (p<0,001) và locus Pt36480 (p<0,05). Sự khác nhau có ý nghĩa giữa hệ số gen dị hợp tử quan sát và mong đợi cũng được tìm thấy ở một số locus ở mức độ quần thể của loài Thông lá dẹt. Sự khác nhau này được tìm thấy ở locus Pt71936 (p<0,05) cho quần thể Yang Ly; locus PtTX3020, Pt71936 (p<0,001), locus Pt36480, Pt26081, Pt30204 (p<0,05) cho quần thể Cổng Trời; locus PRE24, PtTX3020, Pt9383, RPS2, Pt71936 (p<0,001) và locus Pt30204 (p<0,05) cho quần thể Hòn Giao; locus PRE24, Pt30204, RPS2, Pt71936 (p<0,001), locus Pt2030 (p<0,05), locus Pt9383 (p<0,01) cho quần thể Chư Yang Sin (Số liệu không chỉ ra ở đây).
Bảng 3.5. Một số thông số đa dạng di truyền của từng quần thể Thông lá dẹt phân
tích với chỉ thị SSR Quần thể Mức độ quần thể Mức độ loài Yang Ly Cổng Trời Hòn Giao Chƣ Yang Sin Trung bình Na 1,765 1,941 1,824 2,118 1,912 2,471 Ne 1,518 1,667 1,455 1,477 1,529 1,521 Ap 0,059 0,118 0 0,294 0,118 - Ho 0,271 0,316 0,292 0,332 0,303 0,310 He 0.233 0.25 0.2 0.235 0.229 0.234 I 0,373 0,415 0,330 0,390 0,377 0,414 PPB 52,93 52,95 47,06 52,94 51,47 76,19
Ghi chú: Na: số alen trung bình trên một locus; Ne: số alen hiệu quả trên một locus; Ap: số alen hiếm trên một locus; Ho: hệ số gen dị hợp tử quan sát; He: hệ số gen dị hợp tử mong đợi; I: chỉ số đa dạng Shannon; PPB:phần trăm phân đoạn đa hình; (-) không xác định.
Giá trị chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) được tính toán cao nhất ở quần thể Cổng Trời (I = 0,415), sau đó đến quần thể Chư Yang Sin (I = 0,390), tiếp theo
là quần thể Yang Ly (I = 0,373) và thấp nhất là quần thể Hòn Giao (I = 0,330). Tuy nhiên xét về khía cạnh đa hình của các phân đoạn DNA cho thấy tính đa dạng di truyền quần thể không khác biệt nhau nhiều ở cả ba quần thể Yang Ly (PPB = 52,93 %), Cổng Trời (PPB = 52,95 %) và Chư Yang Sin (PPB = 52,94 %), và thấp hơn cả vẫn là quần thể ở Hòn Giao (PPB = 47,06 %).
Thông qua kết quả trong bảng 3.5 cho thấy tính đa dạng di truyền thấp đối với quần thể Hòn Giao và cao ở quần thể Chư Yang Sin. Trong bốn quần thể nghiên cứu thì quần thể Chư Yang Sin thuộc tỉnh Đắc Lắc, còn ba quần thể Yang Ly, Cổng Trời và Hòn Giao thuộc tỉnh Lâm Đồng (khoảng cách giữa quần thể Hòn Giao và Cổng Trời là 54 km; Hòn Giao và Yang Ly 4 km, Cổng Trời và Yang Ly là 50 km; Chư Yang Sin và Hòn Giao, Yang Ly, Cổng Trời là 74; 70 và 40 km, tương ứng). Điều này cũng có thể liên quan tới khác biệt địa lý, sự thay đổi khí hậu, sự trao đổi di truyền của mỗi quần thể,… [41]. Hơn nữa trong quá trình điều tra thực địa, chúng tôi cũng nhận thấy quần thể Thông lá dẹt ở Cổng Trời có số lượng cây trưởng thành nhiều nhất (có 10 cây với đường kính 1,5 - 2 m, cao 30 - 40 m) so với các quần thể ở Hòn Giao và Yang Ly (thường là cây tái sinh có chiều cao khoảng trên 10 m). Kết quả này cho phép nhận định việc giao phấn (pollilation) ở Cổng Trời cao hơn hai quần thể Yang Ly và Hòn Giao.
Để có thêm cơ sở về tính đa dạng di truyền loài Thông lá dẹt, chúng tôi cũng đã phân tích thêm một số thông số di truyền của quần thể Thông lá dẹt với mỗi cặp mồi SSR và được thể hiện trong bảng 3.6 cho thấy, 8 trong số 17 cặp mồi SSR phân tích (PRE24, PtTX3020, Pt36480, Pt9383, PtTX3026, Pt26081, Pt30204 và RPS2) đã chỉ ra tính đa hình. Trong đó, giá trị alen trung bình (Na) cao nhất là cặp mồi PRE24 (4,5) và thấp nhất là cặp mồi Pt26081 (1,75). Kết quả phân tích SSR cũng cho thấy mức độ di nhập gen (Nm) tương đối cao của quần thể Thông lá dẹt khi phân tích với cặp mồi Pt9383 (Nm = 10,796 và Fst = 0,023) và thấp nhất là cặp mồi Pt26081 (Nm = 1,813 và Fst = 0,121). Kết quả này cho phép nhận xét việc di nhập gen rất cao trong quần thể Thông lá dẹt.
Bảng 3.6. Thông số di truyền chính của quần thể Thông lá dẹt phân tích với từng cặp mồi SSR Tên mồi Na Ne I Fst Nm PRE24 4,500 3,505 1.293 0,052 4,520 PtTX3020 3,500 2,507 1,006 0,047 5,085 PtTX3026 2,500 1,568 0,559 0,071 3,272 RPS2 3,750 2,454 0,998 0,095 2,391 Pnh038 1,000 1,000 0,000 - - RPS160 1,000 1,000 0,000 - - PeC26BGT 1,000 1,000 0,000 - - NZPR6 1,000 1,000 0,000 - - Pt26081 1,750 1,362 0,370 0,121 1,813 Pt30204 2,500 1,321 0,440 0,029 8,428 Pt71936 2,000 2,000 0,693 0,000 - Pt87268 1,000 1,000 0,000 - - Pt15196 1,000 1,000 0,000 - - Pt36480 2,000 1,361 0,384 0,076 3,049 Pt9383 2,000 1,917 0,669 0,023 10,796 P5 1,000 1,000 0,000 - - Pt79951 1,000 1,000 0,000 - - Trung bình 1,912 1,529 0,377 0,057 2,315
Ghi chú: Na: Số alen trung bình; Ne: Số alen hiệu quả; I: Chỉ số di truyền theo Shannon; Fst: Hệ số khác biệt di truyền; Nm: Giá trị của di nhập gen, (-) không xác định.
Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và giữa các cá thể trong cùng quần thể ở bảng 3.7 đã chỉ ra, tổng mức độ thay đổi phân tử rất thấp giữa các quần thể (11,94 %) và cao giữa các cá thể trong cùng quần thể (88,06 %) với giá
trị p<0,001. Trong nghiên cứu của Wang và cộng sự (2014) [68] cũng mới chỉ ra tính đa dạng nucleotide cho quần thể Thông lá dẹt ở Lâm Đồng, nhưng chưa đánh giá được mức độ thay đổi phân tử ở mức quần thể. Tuy nhiên so sánh với loài Thông nước (Glyptostrobus pensilis) của Việt Nam nhận thấy, mức độ thay đổi phân tử giữa các quần thể của loài Thông lá dẹt đã thấp hơn nhiều (11,94% so với 33,69%) và cao giữa các cá thể trong quần thể (88,06% so với 66,31%) [46]. Kết quả này cho thấy mức độ đa dạng nguồn gen quần thể Thông lá dẹt - loài đặc hữu của Việt Nam cần phải được các nhà nghiên cứu quan tâm bảo tồn loài.
Bảng 3.7. Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Thông lá dẹt
phân tích với chỉ thị SSR
Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt
Hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt được xác định sau khi so sánh các cặp quần thể với nhau. Kết quả chỉ ra các quần thể Thông lá dẹt nghiên cứu đều có hệ số tương đồng di truyền cao (>0,9), trung bình 0,940. Trong đó quần thể Hòn Giao và Chư Yang Sin có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất (0,970), kết quả này cũng phù hợp khi phân tích với chỉ thị ISSR. Hệ số tương đồng di truyền thấp nhất được xác định giữa quần thể Yang Ly và quần thể Hòn Giao (0,906). Tương tự, khoảng cách di truyền cao nhất được xác định giữa cặp quần thể Hòn Giao/Yang Ly (0,098) và thấp nhất giữa cặp quần thể Chư Yang Sin/Hòn Giao (0,030) (Bảng 3.8).
Nguồn biến thiên Bậc tự
do Tổng bình phƣơng Thành phần biến đổi Tổng sự biến đổi (%) Giá trị p Giữa các quần thể 3 19,992 0,289 11,94 <0,001 Trong các quần thể 66 140,693 2,132 88,06
Bảng 3.8. Hệ số tương đồng (dưới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa 4 quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị SSR
Yang Ly Cổng Trời Hòn Giao Chƣ Yang Sin
Yang Ly 0,054 0,098 0,097
Cổng Trời 0.947 0,058 0,060
Hòn Giao 0,906 0,944 0,030
Chƣ Yang Sin 0,907 0,942 0,970
Mối quan hệ di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt phân tích với chỉ thị SSR
Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa 4 quần thể Thông lá dẹt với chỉ thị SSR được thể hiện trong hình 3.5. Kết quả chỉ ra 4 quần thể Thông nghiên cứu đã hình thành 2 nhóm riêng biệt. Nhóm thứ nhất gồm 2 quần thể Yang Ly và Cổng Trời với khoảng cách di truyền 0,054. Nhóm thứ hai gồm 2 quần thể Hòn Giao và Chư Yang Sin với khoảng cách di truyền 0,030.
Hình 3.5. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 4 quần thể Thông lá
dẹt với chỉ thị SSR.