5. Ý nghĩa khoa học
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tạo mô hình chuột BP và chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm
2.2.1.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết hạt đậu đen b ằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Lorke. Chuột nhịn đói trƣớc 12 giờ thí nghi ệm đƣợc phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần lên đến 8 g/kg (thể tích và
khối lƣợng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết loài Diệp Hạ Châu [22]..
2.2.1.2. Phân nhóm động vật thí nghiệm
Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng dòng Swiss khỏe mạnh đƣợc cân từng con, đánh dấu, phân lô ngẫu nhiên trƣớc khi thí nghiệm.
a. Tạo mô hình chuột béo phì
- Lô nuôi thƣờng (lô 1): Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW).
- Lô nuôi béo (lô 2 đến lô 12): Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần đƣợc trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau.
Các lô chuột đƣợc theo dõi trong vòng 6 tuần, trọng lƣợng của các con chuột đƣợc kiểm tra hàng tuần.
b. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Mô hình chuột ĐTĐ type 2 đƣợc xây dựng trên nhóm chuột béo phì kết hợp với tiêm STZ liều thấp.
Phƣơng pháp gây ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ
Streptozotocin (STZ:2 - deoxy - 2 - (3 - metyl - 3 - nitrosoureido) -
D - glucopyranose) là chất có hoạt tính chống ung thƣ đƣợc chiết xuất từ nấm Streptomyces achromogens. Khả năng gây ĐTĐ của STZ đã đƣợc phát hiện
vào năm 1963. Kể từ đó STZ đƣợc sử dụng rộng rãi trong mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong các nghiên cứu về thuốc [18], [22].
O OH OH OH N H C H2 C N N O O CH3 HO
Tùy vào liều lƣợng STZ và cách thức tiến hành ngƣời ta có thể gây ĐTĐ type1 hay type 2.
ĐTĐ type 1: Với chuộttrƣởng thành, tiêm liều duy nhất từ 40 - 60
mg/kg thể trọng hoặc cao hơn. Với chuột nhắt trƣởng thành, tiêm liều 100 - 150mg/kg thể trọng.
ĐTĐ type 2: Với chuột cống, tiêm STZ liều 100mg/kg vào ngày đầu
tiên sau khi sinh. Với chuột nhắt có thể nuôi với chế độ dinh dƣỡng giàu lƣợng mỡ sau đó tiêm STZ với liều 50 - 100mg/kg.
STZ đƣợc nhận biết và xâm nhập vào tế bào β qua kênh vận chuyển glucose LLUT2. Hoạt động của nó trong tế bào làm tổn thƣơng và alkyl hóa ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tử tế bào. Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí O6
của guanine.
STZ tạo ra nitric oxide (NO) làm tổn thƣơng ADN của tế bào β. Mặt khác, hoạt động của NO làm ức chế chu trình Krebs, giảm tiêu thụ oxy trong ty thể từ đó làm giảm mạnh sự sản xuất ATP và tổn hại đến các nucleotit của tế bào. Đồng thời phân tử này còn ức chế hoạt tính enzyme aconitase. Mặt khác, sự tăng cƣờng loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ sung cơ chất cho xanthine oxidase và tăng cƣờng sản xuất acid uric. Sau đó, xanthine oxidase xúc tác phản ứng tạo thành anion superoxyde (O2
-). Cuối cùng anion superoxyde sinh ra hydrogen peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl (OH-). Các dạng oxy phản ứng này cũng tập trung phá hủy ADN và gây ra những thay đổi bất lợi cho tế bào. NO và các dạng oxy hoạt động còn có thể tạo thành peroxynitrate (ONOO) có độc tính cao. Tổn thƣơng ADN gây ra bởi STZ làm tăng cƣờng quá trình trùng hợp ADP (Poly ADP - ribosylation) dẫn đến làm mất NAD+, xa hơn nó phá hủy ATP dự trữ và sau đó ức chế sự tổng hợp và tiết insulin của tế bào β [18].
c. Phân lô chuột thí nghiệm
Sau khi đã tạo đƣợc chuột béo phì và chuột ĐTĐ type 2 chúng tôi tiến hành phân lô chuột thí nghiệm nhƣ sau :
* Mô hình chuột béo phì
- Lô 1: Chuột nuôi thƣờng (Lô đối chứng (chung cho cả hai mô hình)) - Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị
- Lô 3: Chuột béo phì điều trị bằng cao ethanol - Lô 4: Chuột béo phì, điều trị bằng cao n - hexan - Lô 5: Chuột béo phì, điều trị bằng cao chloroform - Lô 6: Chuột béo phì, điều trị bằng cao ethylacetat
* Mô hình chuột ĐTĐ
- Lô 7: Chuột ĐTĐ type 2, không điều trị
Hình 2.3. Cơ chế gây độc của STZ lên tế bào β của tụy đảo chuột
- Lô 10: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao n - hexan - Lô 11: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao chloroform - Lô 12: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao ethylacetat 2.2.1.3. Tiến hành thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều đƣợc nuôi dƣỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm Hóa sinh - khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Chuột đƣợc cho ăn thức ăn tổng hợp có hàm lƣợng chất béo cao và uống nƣớc bình thƣờng. Các lô chuột đƣợc nuôi trong các lồngriêng biệt để tránh lây chéo có thể xảy ra qua đƣờng hô hấp và tiếp xúc. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến, kết quả thí nghiệm.
Thời gian điều trị là 3 tuần với liều lƣợng cho uống là 2000mg dịch chiết/kg thể trọng/ngày. Cao của các phân đoạn dịch chiết đƣợc hoà vào nƣớc ấm và cho chuột uống hàng ngày vào mỗi buổi sáng.Trƣớc khi cho chuột uống các cao dịch chiết, chuột đƣợc nhịn đói nhằm tránh sự ảnh hƣởng của thức ăn đến quá trình hấp thụ cao dịch chiết.
Hình 2.4: Phƣơng pháp lấy máu đo glucose huyết
Khối lƣợng và nồng độ glucose huyết của các lô chuột đƣợc theo dõi vào các thời điểm: trƣớc khi tiến hành điều trị, sau điều trị 1, 2, 3 tuần.Vào ngày cuối cùng của thời gian thí nghiệm, sau khi kiểm tra glucose huyết, tiến hành lấy máu tổng số để xác định các chỉ số lipid huyết thanh.
2.2.2. Phương pháp định lượng một số chỉ số hóa sinh
2.2.2.1. Phương pháp định lượng glucose huyết
Máu dùng để định lƣợng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột. Định lƣợng glucose huyết bằng máy đo đƣờng huyết tự động và bộ kít thử tƣơng ứng (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA).
Hình 2.5: Phƣơng pháp lấy máu đo glucose huyết
* Nguyên tắc
Nguyên tắc hoạt động của phƣơng pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và đƣợc đo bằng phƣơng pháp quang học để định lƣợng glucose huyết.
+ Phản ứng 1: khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, dƣới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose trong máu phản ứng với oxy (không khí) tạo thành acid gluconic và hydro peroxide (H2O2).
+ Phản ứng 2: hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và đƣợc thiết bị đo quang học trong máy One Touch Ultra chuyển hóa định lƣợng biểu thị bằng số mmol/l hoặc mg/dl glucose.
* Tiến hành
Ấn nút điều khiển để khởi động máy. Gắn que thử vào máy. Dùng kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự nhiên,
phải là giọt máu tròn đầy, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử. Sau 5 giây, kết quả nồng độ đƣờng huyết sẽ hiển thị trên màn hình.
2.2.2.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid,
HDL - c, LDL - c) đƣợc xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh - Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô). Nguyên tắc xác định nhƣ sau:
a. Định lƣợng triglycerid
Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lƣợng glycerol giải phóng ra bằng phƣơng pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyrin và 4 - chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Đo mật độ quang học quynonimin ở bƣớc sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.
b. Định lƣợng cholesterol toàn phần
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase. Các phản ứng:
Đo mật độ quang của Quynonimin ở bƣớc sóng 546nm (bằng máy Olympus AU400), so với ống chuẩn để tính kết quả.
c. Định lƣợng HDL - c.
Nguyên tắc: xét nghiệm gồm hai bƣớc. Bƣớc thứ nhất cholesterol trong
chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bƣớc thứ hai cholesterol trong HDL đƣợc định lƣợng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL.
Bƣớc 1
Bƣớc 2
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Chỉ số glucose huyết đƣợc so sánh giữa thời điểm trƣớc và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.
X1 – Tỷ lệ % tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt đƣợc kiểm định bằng thuật toán t- test student với p< 0,05 có ý nghĩa thống kê.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL - C, LDL - C, TG) được tính theo
công thức dưới đây
Tỷ lệ % hạ glucose huyết:
X2 - Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B - Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt đƣợc kiểm định bằng thuật toán t - test student với p< 0,05 có ý nghĩa thống kê.
- -
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo mô hình chuột BP thực nghiệm, chuột ĐTĐ type 2.
3.1.1. Kết quả tạo mô hình chuột BP thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lƣợng ban đầu là 17 - 20g) đƣợc chia làm 12 lô, đƣợc phân lô ngẫu nhiên mỗi lô 6 con.
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng).
Lô 2 - 12: Cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao theo bảng 2.1. Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân khối lƣợng chuột. Kết quả sự thay đổi của lô nuôi thƣờng và lô nuôi béo đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1
A – Chuột béo B – Chuột thƣờng Hình 3.1. Chuột béo và chuột thƣờng sau 6 tuần nuôi
Bảng 3.1. Khối lƣợng trung bình (tính theo gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
Hình 3.2.Khối lƣợng trung bình (tính theo gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau
Qua thƣ̉ nghiệm chúng tôi đã tạo thành công mô hình chuột béo phì thƣ̣c nghiệm . Bảng 3.1 và hình vẽ cho thấy chuột nuôi theo chế độ ăn có hàm lƣợng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng khối lƣợng cơ thể lớn hơn nhiều so với chuột ăn thức ăn thƣờng. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p< 0,05. Cụ thể : chuột nuôi bằng thƣ́c ăn thƣờng cơ thể tăng thêm 16,79g ƣ́ng với 192,50% so với ban đầu . Trong khi chuột nuôi bằng thƣ́c ăn giàu lipid và cholesterol khối lƣợng cơ thể tăng thêm 35,34g ƣ́ng với
Nhóm
Khối lƣợng (g) Tỷ lệ % sau 6
tuần so với ban đầu Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6
Ăn thƣờng 18,15 ±1.07 20,19 ±0.38 22,96 ±0.57 25,74 ±0.62 29,17 ±1.01 31,76 ±1.12 34,94 ±1.07 ↑92,50% Ăn béo 17,92 ±1,35 22,74 ±1,72 28,33 ±1,38 35,83 ±1,74 41,92 ±1,68 48,85 ±1,45 53,26 ±1,81 ↑197,21%
297,21% và cao gấp 2,10 lần so với chuột nuôi thƣờng . Kết quả trên là khả quan và phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu thực nghiệm trên chuột của các tác giả trong và ngoài nƣớc. Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Liên và cộng sự, sau 6 tuần khối lƣợng của chuột nuôi béo tăng gấp 1,55 lần tƣơng ứng với 55,01% với chuột ăn thƣờng. Theo quan sát của chúng tôi, chuột béo phì có biểu hiện kém linh hoạt, vận động đi lại chậm chạp hơn so với chuột nuôi ở chế độ bình thƣờng. Điều đó cho thấy chúng đã ít nhiều bị ảnh hƣởng đến yếu tố thể chất. Nhƣ vậy, chế độ thức ăn giàu chất béo có ảnh hƣởng rõ rệt đến độ tăng khối lƣợng của chuột [9].
Chọn ngẫu nhiên 10 con chuột nuôi béo . Sau khi cho nhịn đói 12 giờ, chúng tôi lấy máu tổng số và phân tích chỉ số hoá sinh để đánh giá ảnh hƣởng của chế độ nuôi béo đến chỉ số lipid trong huyết thanh .
Các chỉ số lipid (mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thƣờng 3,82 1,42 1,55 2,35 6,47 ±0,31 ±0,37 ±0,25 ±0,22 ±0,29 Nhóm ăn béo 6,13 2,45 0.85 4,06 8,79 ±0,18 ±0,28 ±0,24 ±0,48 ±0,36 So sánh lô béo/thƣờng ↑1,60 ↑1,73 ↓1,82 ↑1,72 ↑1,36
Bảng 3.2. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm.
Hình 3.3. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm.
Qua bảng số liệu bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa lô nuôi thƣờng và lô nuôi béo. Cụ thể:
Hàm lƣợng glucose của chuột béo phì là 8,79 mmol/l, tăng 35,86% so với chuột nuôi thƣờng (6,47mmol/l) với mức ý nghĩa p< 0,05
Nồng độ cholesterol của chuột béo phì là 6,13 mmol/l, tăng 60,47% so với lô nuôi thƣờng (3,82 mmol/l) với p< 0,05,Triglycerid của chuột béo phì là 2.45 mmol/l, tăng 103% so với lô nuôi thƣờng (1,42mmol/l) với p<0,05.
Hàm lƣợng LDL - c trong máu chuột béo phì là 4,06 mmol/l, tăng 72,76% so với lô chuột nuôi thƣờng (2,35 mmol/l) với p < 0,05, Trái lại, HDL - c lại có sự sụt giảm mạnh, giảm tới 45,16% so với chuột nuôi thƣờng (1,55mmol/l), với p < 0,05.
Khi chuột đƣợc nuôi bằng thƣ́c ăn giàu lipid và cholesterol thì không chỉ tăng về khối lƣợng mà còn tăng về các chỉ số lipid nhƣ cholesterol, triglyceride, LDL - c tăng rõ rệt. Qua bảng số liệu ta thấy rằng béo phì đã kéo theo sƣ̣ rối loạn trao đổi glucid làm nồng độ glucose trong máu tăng cao . Điều này chƣ́ng tỏ đã có sự biểu hiện của hiện tƣợng kháng insulin , dẫn tới nguy cơ mắc Đ TĐ type 2
của chuột béo phì. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với quy luật thực tế và nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự là chuột ăn thức ăn có hàm lƣợng lipit cao trong thời gian dài rất dễ dẫn đến rối loạn trao đổi chất glucid - lipid [23].
Từ các dẫn liệu khối lƣợng cơ thể, các chỉ số mỡ máu tăng cao bất thƣờng, cùng với sự hoạt động kém linh hoạt cuả chuột nuôi béo so với chuột nuôi thƣờng. Chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng thực nghiệm đã thành công. Chuột béo phì tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type2 thực nghiệm.
Trên thế giới có rất nhiều mô hình gây ĐTĐ thƣ̣c nghiệm . Thông thƣờng đối với ĐTĐ type 1 ngƣời ta tiêm STZ hoặc alloxan ở liều cao vào chuột mà không cần phải qua thời gian nuôi béo do tác dụng phá huỷ hoàn toàn tế bào β của đảo tuỵ bởi STZ hoặc alloxan . Đối với mô hình ĐTĐ type 2 lại tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ dòng chuột , thời gian nuôi , chế độ ăn thƣ́c ăn béo. Chuột béo phì tiêm STZ hoặc alloxan liều đơn , chuột béo phì tiêm STZ liều thấp kết hợp nicotineamide , chuột béo phì tiêm STZ liều thấp lặp lại .
STZ (Streptozotocin) có tên hóa học là: 2 - deoxy - 2 - (3 - metyl - 3 - nitrosoureido) - D - glucopyranose, đƣợc phân lập đầu tiên vào năm 1960 từ Streptomyces achromogens. Đây là kháng sinh có hoạt tính chống ung thƣ, tiêu u và gây đái tháo đƣờng. STZ đã kết hợp với một protein vận chuyển glucose qua màng vài tế bà o GLUT 2 (glucose transporter ) để đƣa vào tế bào β và gây phá huỷ AND của tế bào β tuyến tuyến tuỵ . Tƣ̀ đó gây suy yếu hoặc phá huỷ các tế bào β, gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới khả năng tiết insu lin [20], [21].
Với nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn béo trong thời gian dài và tiêm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrat 0,01M, pH 4,5) với liều đơn 110
nghiệm. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.3 và có so sánh với các lô chuột chỉ ăn thƣờng tiêm STZ, chuột thƣờng và chuột béo chỉ tiêm đệm (Citrat