1.3.1.1 Những nghiên cứu về phân loại thực vật
Liu et al. (2011) [56] đã nghiên cứu phân tử và hình thái liên quan đến chi Holcoglossum và đã hình thành hai chi lan mới là Paraholcoglossum và Tsiorchis.
Holcoglossum là một chi phong lan nhỏ gồm 12 loài khác nhau, từ Tây
Nam Trung Quốc sang Thailand và Đông Bắc Ấn Độ. Nghiên cứu phân tử và hình thái học đã đƣợc thực hiện để thiết lập các mối quan hệ phát sinh loài trong chi này, các mối quan hệ giữa loài và mối quan hệ với các chi tƣơng tự, chẳng hạn nhƣ Rhynchostylis, Aerides và Vanda, vẫn còn chƣa rõ ràng.
Ngoài phân tích hình thái, phân tích suy luận Bayes đƣợc thực hiện dựa trên hƣơng thơm, nhân ITS, lục lạp trnL-F và gen matK của 31 loài (15
Holcoglossum, 14 Aeridinae, 2 Outgroups) đại diện cho tất cả các nhóm lớn
có liên quan đến Holcoglossum. Kết quả cho thấy Holcoglossum có 3 nhánh,
nhánh có liên quan gần hơn với Rhynchostylis, Aerides và Vanda so với
nhánh Holcoglossum. Các Holcoglossum nhánh đƣợc chia thành ba nhánh
phụ; khoảng cách di truyền giữa ba nhánh phụ này cũng phù hợp với sự phân định trên. Kết luận về phân tử cũng trùng hợp với kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái riêng biệt của chúng.
1.3.1.2 Nghiên cứu về tạo giống và nhân giống
Nattaporn Kerdsuwan and Sompong Te-chato (2012) [59]. đã nghiên cứu tạo giống mới thông qua xử lý đột biến tạo cây đa bội thể. PLBs (Protocorm-like bodies) ở giai đoạn của GI5 của phong lan Chang Daeng (Rhynchostylis gigantea var. rubrum Sagarik) nuôi trong môi trƣờng New
Dogashima (NDM) lỏng với 2% sucrose và 15% nƣớc dừa (CW) đã đƣợc sử dụng để xử lý với colchicines để tăng gấp đôi nhiễm sắc thể. Các xử lý bao gồm 5 nồng độ colchicin (0; 0,05; 0,10; 0,15 và 0,20%) cùng với 3 thời gian xử lý 24, 48 và 72 giờ. Kết quả cho thấy, PLBs nhúng chìm trong colchicines ở nồng độ 0,20% trong 72 giờ có tỷ lệ sống là 26% và tạo ra tỷ lệ cây tứ bội cao nhất (60%). Tốc độ tăng trƣởng và chiều cao của cây tứ bội, bao gồm cả hình dạng và kích thƣớc lá thấp hơn nhiều so với đối chứng. Đặc điểm giải phẫu của các cây tứ bội cho thấy mật độ lỗ khí khổng cao nhất 3,00 tế bào/mm2 so với cây con đối chứng. Số lƣợng trung bình của lục lạp trong cây con tứ bội là 46 tế bào lục lạp/bảo vệ, thấp hơn so với các cây lƣỡng bội.
Lan Đai Châu là lan đơn thân, vì vậy, không thể nhân giống bằng tách thân. Hạt lan Đai Châu cũng rất khó mọc đƣợc trong điều kiện tự nhiên nên phƣơng pháp nhân giống in vitro là phƣơng pháp tối ƣu để nhân giống loại lan này. Các tác giả trên thế giới đã quan tâm nghiên cứu về phƣơng pháp nhân giống từ hạt trên môi trƣờng nhân tạo.
Các tác giả Zhi-Ying Li and Li Xu (2009) [70] đã nghiên cứu nhân nhanh giống hoa lan Đai Châu đột biến, màu trắng Rhynchostylis gigantea
(Lindley) Ridley thông qua protocorm (PLB) từ hạt chƣa trƣởng thành (nuôi cấy phôi 4 tháng tuổi), 75% PLB phát triển trên môi trƣờng MS với 0,05 mg/l 6-BA và 0,2 mg/l NAA trong vòng 70 ngày kể từ ngày chuyển đến môi trƣờng MS với 2,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA đã tạo thành mô sẹo và sau đó phát triển thể chồi với 2-4 lá. Môi trƣờng phát sinh chồi là MS có chứa 100 g/l chuối nghiền, rễ và chồi sinh trƣởng thuận lợi. Cây con sau in vitro đạt 95% sống sót.
Hạt giống của loài phong lan Đuôi Cáo (Rhynchostylis retusa Blume) nảy mầm đƣợc trong điều kiện in vitro trên môi trƣờng MS. Tƣơng tự kết quả nghiên cứu của Anil Kumar et al. (2002) [40], Dennis Thomas and Alwin Michael (2007) [44] đã nghiên cứu trên môi trƣờng này có bổ sung 15% nƣớc dừa, cho thấy 93% các mô nuôi cấy tái sinh thành cây con sau 90 ngày. Cây con đƣợc cấy chuyển trên MS có bổ sung kinetin (Kn) hoặc thidiazuron (TDZ), có hoặc không có than hoạt tính (AC), cho hình thành sự đa chồi cao. Số lƣợng chồi nhiều nhất là 8,2 chồi đã đƣợc quan sát trên môi trƣờng MS có bổ sung 2 TDZ mM và AC. Các chồi đƣợc tạo rễ trên môi trƣờng ½ MS có bổ sung 2 mM axit indole-3-butyric (IBA) và đƣợc ra ngôi thành công. Trong số 45 cây con đƣợc ra ngôi có 40 cây sống sót. Kết quả của các tác giả rất hữu ích trong nhân nhanh giống và bảo tồn các loài phong lan quý này.
Năm 2010, Distabanjong et al. [45] đã sử dụng hạt phong lan
Rhynchostylis gigantea (Lindley) Ridley đƣợc lấy từ quả 7-9 tháng và nuôi
cấy trên môi trƣờng rắn để làm tăng khả năng nảy mầm của hạt giống. Tỷ lệ nảy mầm đạt cao nhất của Rhynchostylis thu đƣợc trên môi trƣờng Vacin and Went (VW), có bổ sung 150ml/l nƣớc dừa và 100g/l dịch chiết khoai tây. Các môi trƣờng nhân nhanh tốt nhất (tăng 1,7 lần so với trọng lƣợng tƣơi ban đầu trong vòng 9 tháng) là VW có bổ sung 150ml/l nƣớc dừa và 1 mg/l phân bón phong lan (công thức 21-21-21). Việc bổ sung 2-4% mannitol là nồng độ tốt nhất cho sự duy trì sinh trƣởng, chậm kéo dài trong 12 tháng mà không làm
thay đổi môi trƣờng. Tất cả các cây đều sinh trƣởng tốt sau khi chuyển sang môi trƣờng nhân nhanh.
Lan Đai Châu không chỉ nhân giống từ hạt mà còn đƣợc nhân giống từ nuôi cây mô tế bào. Các chồi non (dài khoảng 10mm) của loài lan
Rhynchostylis rubrum, có tỷ lệ tạo dạng đa chồi là cao nhất (100%), số chồi
(10 chồi/mẫu cấy) và phôi callus (EC) (56%). Sự sản sinh các callus trên cả 2 loại môi trƣờng VW và NDM có bổ sung sucrose 2% và 15% nƣớc dừa (CW) ở điều kiện sáng hoặc tối gần nhƣ giống nhau. Te-chato et al., 2010 [66], đã nghiên cứu và quan sát thấy. Các callus đƣợc cấy chuyển trên môi trƣờng NDM trong điều kiện ánh sáng đã chuyển sang màu xanh lá cây và sau đó hình thành phôi soma với số lƣợng (9 phôi/callus) và tỷ lệ cao nhất (79,8%). Trong 1 tháng, những phôi nảy mầm khi đƣợc bổ sung AC (than hoạt tính) trong môi trƣờng nuôi cấy. Các chồi cao hơn 3 cm với số lƣợng rễ trung bình từ 2-3, đã đƣợc ra ngôi thành công ở ngoài vƣờn ƣơm. Kỹ thuật này rất hữu ích cho vi nhân giống cũng nhƣ cho việc chuyển gen vào Rhynchostylis rubrum.
Kaewkhiew and Kaewduangta (2010) [50] đã nghiên cứu sự thay đổi của các chất phụ gia tự nhiên trong môi trƣờng đến sinh trƣởng của cây lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea (Linldey) Rildey) nuôi cấy mô tế bào. Môi trƣờng VW có thêm chất phụ gia tự nhiên đƣợc sử dụng để thay thế cho môi trƣờng hóa sinh đã đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào. Kết quả cho thấy công thức môi trƣờng 2g/l than tre + 5g/l bột nhộng + 50g/l chuối nghiền + 50g/l gạo lật + 150mg/l nƣớc dừa là tốt nhất cho sinh trƣởng, phát triển của cây con, chiều cao cây đạt 8,05 cm, trọng lƣợng tƣơi 1753g, số lá 5 lá, số rễ 3,9 rễ.
Thƣờng nhân giống hoa lan chỉ đạt đƣợc thông qua protocorm, tức là giai đoạn trƣởng thành. Để sản xuất trực tiếp từ chồi và nụ tái tạo nhanh chóng với một hệ số cao, phƣơng pháp nuôi cấy tế bào lát mỏng (tTCL) đƣợc tác giả Bui Van Le (1999) [43] thử nghiệm trên lan Rhynchostylis gigantea
(Lindley) Ridley. Lớp tế bào mỏng ngang 0,3-0,5mm đƣợc cắt từ chồi đỉnh của cây một năm tuổi, nuôi cấy trên môi trƣờng MS có sự kết hợp tốt nhất cho tối đa tái sinh chồi là 3mM TDZ và 3 mM BAP, cho 11,7 chồi mỗi tTCL. Rễ đã thu đƣợc với 10mM forchlofenuron và 1% sucrose. Các cây trong ống nghiệm (dài>3cm) thu đƣợc từ 4 đến 6 tuần sau khi nuôi cấy tTCLs. Phƣơng pháp vi nhân giống hiệu quả, sản xuất trực tiếp từ chồi mà không qua giai đoạn protocorm của các loài phong lan có thể đạt đƣợc bằng cách sử dụng phƣơng pháp tế bào lát mỏng.
Nhìn chung các biện pháp nhân giống đã đƣợc các tác giả trên thế giới nghiên cứu thành công, từ nuôi cấy hạt chƣa trƣởng thành, hạt trƣởng thành và từ đỉnh sinh trƣởng trong ống nghiệm. Các tác giả cũng đã xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy, nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh. Trong đó, có sử dụng cả môi trƣờng hóa sinh và các chất tự nhiên. Chất lƣợng cây giống sau nuôi cấy đạt tiêu chuẩn, có thể đáp ứng cho sản xuất.
1.3.1.3 Nghiên cứu về đặc điểm nông sinh học
Hiện nay, chƣa có những nghiên cứu về đặc điểm nông sinh học trên hoa lan Đai Châu, chúng tôi tham khảo kết quả nghiên cứu trên các loài lan khác có đặc điểm nông sinh học gần giống với lan Đai Châu. Các kết quả nghiên cứu này sẽ đƣợc kế thừa, so sánh, đánh giá trong các nghiên cứu trên cây lan Đai Châu.
Các tác giả Zotz and Winkler (2013) [71] đã nghiên cứu rễ khí sinh của phong lan phụ sinh: Vỏ rễ và chức năng hấp thụ nƣớc và dinh dƣỡng. Các vỏ
rễ xốp, đƣợc cấu tạo bởi nhiều lớp biểu bì, mà khi trƣởng thành bao gồm các tế bào chết, thƣờng đƣợc mô tả nhƣ một sự thích nghi quan trọng của phong lan phụ sinh. Tuy nhiên, bằng chứng định lƣợng cho các chức năng, ví dụ nhƣ hiệu quả và hấp thu nƣớc, dinh dƣỡng, duy trì chất dinh dƣỡng, giảm sự mất nƣớc, bảo vệ cơ khí, hoặc tránh quá nóng. Tác giả đã thử nghiệm khái niệm ban đầu đƣợc đƣa ra bởi Went năm 1940 rằng vỏ rễ cho phép các cây lƣu giữ và cố định những dung dịch đầu tiên đến từ trận mƣa rào, đó là những thay đổi lớn nhất với các chất dinh dƣỡng. Đầu tiên, các tác giả cho thấy rằng vỏ của một số lƣợng lớn các loài lan hút các dung dịch trong vài giây, trong khi bay hơi từ vỏ mất vài giờ. Ion tích điện đƣợc giữ lại trong vỏ rễ có thể là do điện tích dƣơng và âm trong vách tế bào, trong khi các hợp chất tích điện bị mất vào môi trƣờng bên ngoài. Cuối cùng, các tác giả đã chứng minh rằng sự hấp thu chất dinh dƣỡng sau hai pha động học với một hệ thống vận chuyển hoạt động có hiệu quả cao ở nồng độ bên ngoài thấp. Nhƣ vậy, kết quả của tác giả hỗ trợ mạnh mẽ cho giả thuyết Went: Vỏ rễ đáp ứng một chức năng quan trọng trong sự hấp thu chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng sống phụ sinh.
Rodica Bercu et al. (2011) [64] đã mô tả các đặc điểm giải phẫu cấu trúc về rễ, thân, lá mọc trên không của loài lan Hồ Điệp sống phụ sinh (Phalaenopsis amabilis (L.) Blume). Rễ mọc trên không là đặc điểm điển hình giúp loài hoa này thích nghi với môi trƣờng sống phụ sinh và ẩm ƣớt. Thân cây cho thấy loài này có cấu trúc đặc trƣng chính của cây một lá mầm. Lá và hoa cũng bộc lộ cấu trúc tƣơng tự, cả hai đều mọng nƣớc và thịt lá đồng nhất với không gian trên không, sau này đƣợc coi nhƣ là một sự thích nghi với môi trƣờng thực vật.
Cả hai nhóm tác giả Zotz and Winkler (2013) [71] và Rodica Bercu et al. (2011) [64] đều cho rằng: rễ lan hấp thu chất dinh dƣỡng sau hai pha động học với một hệ thống vận chuyển hoạt động có hiệu quả cao ở nồng độ bên
ngoài thấp. Kết quả nghiên cứu của tác giả đã khiến chúng tôi liên tƣởng đến chất lƣợng nƣớc tƣới và nồng độ phân bón có tác động lớn đến sinh trƣởng, phát triển của cây. Yếu tố chính là pH và EC (nồng độ ion trong môi trƣờng). Cây có khả năng hấp thu nƣớc và dinh dƣỡng mạnh ở điều kiện môi trƣờng có EC thấp, kết luận này đã giải thích cho hiện tƣợng sau mỗi trận mƣa rào cây lan nói chung và lan Đai Châu nói riêng sinh trƣởng rất mạnh. Đây là cơ sở để chúng tôi đƣa ra các nghiên cứu về chất lƣợng nƣớc tƣới, số lần tƣới và các loại phân bón (với pH và EC khác nhau) trên lan Đai Châu.
1.3.1.4 Nghiên cứu về quang chu kỳ và ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sinh trưởng, ra hoa của cây
Các tác giả trên thế giới cũng đã quan tâm nghiên cứu về quang chu kỳ và kỹ thuật tác động nhằm tăng khả năng sinh trƣởng, phát triển của cây. Kannika Banyai et al. (2010) [51] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của quang chu kỳ và axit Giberilic (GA3) đến sự ra hoa trái mùa của lan Rhynchostylis gigantea (Lindl.) Ridl. Cây 2,5 năm tuổi đặt trong điều kiện tự nhiên và trong điều kiện ngày ngắn (10:14h sáng: tối) phun GA3 3000 ppm và đối chứng không ứng dụng GA3, từ tháng 6 đến tháng 9. Kết quả thấy rằng khi cây chỉ đƣợc xử lý ngày ngắn hoặc chỉ đƣợc phun GA3 3.000 ppm và xử lý ngày ngắn với phun GA3 3.000 ppm cho hoa sớm hơn đáng kể so với đối chứng cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Phân tích hàm lƣợng dinh dƣỡng thực vật cho thấy hàm lƣợng N và P trong tháng hai là thấp nhất trong các cây đƣợc phun GA3 và sai khác có ý nghĩa so với công thức này không xử lý GA3. Tuy nhiên, hàm lƣợng K trong tháng 9 là thấp nhất ở cây trồng trong điều kiện ngày ngắn và sai khác có ý nghĩa so với các cây trồng trong điều kiện tự nhiên.
Watthanasrisong et al. (2010) [69] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện ngày ngắn với nhiệt độ thấp đến sinh trƣởng của lan Rhynchostylis
gigantea (Lindley) Ridley var. alba Hort cây 3 năm tuổi trong điều kiện tự nhiên hoặc ngày ngắn (sáng: tối là 10:14 giờ) với nhiệt độ thấp (18°C) vào các thời điểm khác nhau trong năm (tháng 3, tháng 4 và tháng 5), là 30, 60 và 90 ngày. Kết quả cho thấy, cây hoa lan xử lý trong điều kiện nhiệt độ thấp, trong tháng 4 và xử lý ngày ngắn 90 ngày cho thời gian ra hoa dài hơn những cây trong điều kiện tự nhiên khoảng 40 ngày. Những cây trồng trong tháng 5 trong điều kiện ngày ngắn 30 ngày, cho thời gian ra hoa dài nhất và có ý nghĩa nhất so với các điều kiện khác. Hoa của những cây đƣợc trồng trong tháng tƣ, xử lý ngày ngắn 30 ngày có ý nghĩa đáng kể hơn so với những cây phát triển trong điều kiện tự nhiên khoảng 6 ngày.
Tác giả Phengphachanh et al. (2012) [62], đã nghiên cứu ảnh hƣởng của độ dài ngày và GA3 đến quá trình nở hoa và ngƣỡng hoóc môn nội sinh trong quá trình ra hoa của lan Đai Châu (Rhynchostylis gigantea (Lindley) Ridley). Cây 3 năm tuổi đƣợc trồng trong điều kiện tự nhiên ngày ngắn (10 giờ sáng) kết hợp với GA3 ở nồng độ 0 và 3000ppm trong 3 tháng. Kết quả cho thấy ngày ngắn có thể kích thích cây ra hoa nhanh hơn trong điều kiện tự nhiên trong vòng 2 tuần. Abscisic acid (ABA) trong lá giảm ở tất cả các thí nghiệm xử lý GA3 trong điều kiên tự nhiên, giá trị ABA nhỏ nhất ở 30 ngày. Hơn nữa, dƣới điều kiện ngày ngắn, GA3 làm giảm ABA ở lá. Ở chồi, hàm lƣợng ABA tăng lên trong 0 đến 30 ngày ở tất cả các thí nghiệm, sau đó GA3 hầu nhƣ làm giảm hàm lƣợng ABA ở điều kiện tự nhiên, trong khi hàm lƣợng ABA giữ ổn định trong điều kiện ngày ngắn. Mặt khác, GA3 có tác dụng phân hủy Trans-Zeatin Riboside (T-ZR) trên lá trong điều kiện ngày ngắn, nhƣng việc này không xảy ra ở chồi. Tác giả kết luận: “Sự giảm của ABA và tăng T-ZR trên lá hoặc chồi có thể liên quan đến sự xuất hiện mầm hoa và nở hoa của lan Đai Châu đặc biệt trong điều kiện ngày ngắn”.
Rhynchostylis gigantea (Lindl.) Ridl. thƣờng ra hoa trong thời gian
mùa đông, tháng 1 - tháng 2. Có một số kết quả nghiên cứu đã công bố rằng: trồng lan Rhynchostylis gigantea dƣới điều kiện ngày ngắn có thể ra hoa
nhanh hơn so với điều kiện tự nhiên. Phengphachanh Bounma et al. (2013) tiến hành nghiên cứu để xác định các biểu hiện gen trong quá trình khởi phát hoa của cây. Cây lan R. gigantea trồng trong điều kiện tự nhiên và điều kiện
ngày ngắn. Các đỉnh chồi của cây đƣợc thu thập 5 ngày 1 lần, sau đó, mỗi mẫu đƣợc sử dụng để chiết suất RNA tổng số và cDNA tổng hợp. Năm mƣơi tám mồi với oligo dT12VA, dT12VC, dT12VG và dT12VT đƣợc sàng lọc. Kết quả phân tích đa hình cho thấy 9 TDFBs (TDFB2 đến TDFB10) có những tƣơng đồng với các promoter gen (1) gen kích thích hoa đặc biệt của
Oncidium Gower Ramsey, (2) các bảng mã hóa gen protein của Phalaenopsis equestris và (3) xuân hóa gây ra quá trình chuyển đổi gen của hoa Dendrobium nobile. Nghiên cứu này có thể gợi ý rằng ngày ngắn là một yếu