Xoài là loại trái có giá trị xuất khẩu cao. Do đó, nhiều nƣớc quan tâm nghiên cứu cây xoài về nhiều mặt. Từ 6-9 tháng 4 năm 1999, tại Thái Lan đã tổ chức Hội nghị quốc tế chuyên đề về Xoài lần thứ VI, gồm 189 khách tham dự từ Thái Lan và 156 khách đến từ 29 nƣớc khác. Hội nghị đã có các báo cáo liên quan về việc sử dụng paclobutrazol để kích thích ra hoa (An Độ), tăng năng suất với acid boric 1,5% phun trên phát hoa (Israel), làm thế nào để đạt năng suất cao (Nam Phi), sự ra hoa (úc),... Một số nghiên cứu về bảo vệ cây nhƣ tính nhạy cảm của sự thụ tinh ở hoa xoài (Đài Loan), kiểm soát sinh học các loài côn trùng, bọ cánh cứng (Nam Phi),...Đặc biệt là các nghiên cứu về công nghệ sinh học và chƣơng trình tạo giống ở xoài nhƣ phát triển ngân hàng gen xoài của vƣờn nhiệt đới Fairchild (Mỹ, Ấn Độ, úc), hóa phân loại học (chemotaxonomy) các Mangifera spp. và khả năng tạo giống xoài trong tƣơng lai (Thái Lan và Nhật), khả năng sử dụng bản đồ phân tử để tạo giống xoài, gen đánh dấu, tạo dòng, bản đồ gen, kĩ thuật di truyền. Thành công trong sự đƣa DNA lạ vào gen xoài (úc, Brazil) cho thấy trái xoài lai rất nhỏ có khả năng kháng nấm bệnh [66]. Trong Hội nghị, các nghiên cứu về sự rụng hoa và trái non chƣa thấy đƣợc đề cập. Tuy nhiên, Thái Lan đã nghiên cứu hiện tƣợng này trên các giống xoài khác nhau của Thái. Riêng tại Việt Nam, chƣa thấy có công bố tài liệu nào nghiên cứu về sinh lí trên sự rụng trái non xoài.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
+ Trái xoài (Mangifera indica L., giống trồng Cát Hòa Lộc) ở 0 3 7 10 ngày tuổi , từ các cây xoài ghép trƣởng thành 5 năm tuổi đƣợc trồng tại Trại Giống Cây Trồng Đồng Tiến - Hốc môn (TP Hồ Chí Minh).
+ Khúc cắt vùng rụng trái non xoài (Mangifera indica L., giống trồng Cát Hòa Lộc), ở ngày tuổi thứ 7.
+ Khúc cắt vùng rụng lá của cây mầm đậu (Dolichos sp.) 7 ngày tuổi (kể từ khi nảy mầm).
+ Khúc cắt diệp tiêu của cây mạ lúa (Oryza sativa L.) 72 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
+ Trụ hạ diệp của cây mầm xà lách (Lactuca sativa L) 18 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
+ Tử diệp của cây mầm dƣa leo (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
Phương pháp
2.1. Theo dõi sự tăng trưởng trái và hiện tượng rụng ngoài thiên nhiên
2.1.1. Theo dõi sự tăng trưởng trái
Để thiết lập đƣờng cong tăng trƣởng trái, trọng lƣợng tƣơi của 10 trái đƣợc hái ngẫu nhiên theo thời gian và cân ngay sau đó. Trọng lƣợng tƣơi của một số thành phần trái cũng đƣợc xác định theo thời gian: hột và vỏ hột, vỏ hột, nhân trái, phôi và vùng phôi từ phôi tâm.
2.1.2. Theo dõi sự rụng trái theo thời gian ở các giai đoạn tăng trưởng của phát hoa
Để theo dõi sự rụng trái bắt đầu xuất hiện từ giai đoạn nào trong quá tình tăng trƣởng của phát hoa, trục phát hoa đƣợc chia thành 4 giai đoạn:
13
- Giai đoạn 1: phát hoa dài độ 1cm (giai đoạn cựa gà);
- Giai đoạn 2: phát hoa sau giai đoạn 1 khoảng 4 ngày, dài độ 10 đến 15 cm. Lúc này trục phát hoa đã phân nhánh thứ cấp nhƣng hoa chƣa nở;
- Giai đoạn 3: phát hoa sau giai đoạn 2 khoảng 3 ngày, dài 25 - 30 cm. Lúc này trên các nhánh thứ cấp, gần gốc trục phát hoa, có 5-7 hoa đã nở;
- Giai đoạn 4: phát hoa sau giai đoạn 3 khoảng 3 ngày, kích thƣớc tối đa. Lúc này, có 10-15 hoa (hoặc hơn) trên các nhánh thứ cấp bắt đầu nở.
Trên mỗi giai đoạn, hoa đƣợc đánh dấu ở phía dƣới vùng rụng (phần gần thân). 15 hoa lƣỡng tính đƣợc theo dõi từ 10 trục phát hoa. Hoa vừa nở đƣợc tính là ngày 0. số trái rụng đƣợc đếm mỗi ngày. Phần trăm trái rụng đƣợc tính theo thời gian.
2.1.3. Theo dõi hiện tượng rụng theo thời gian ở giai đoạn phát hoa đạt kích thước tối đa
10 hoa lƣỡng tính đƣợc chọn ngẫu nhiên trên mỗi nhánh hoa, 10 nhánh hoa đƣợc chọn ngẫu nhiên trên mỗi trục phát hoa ở giai đoạn 4, mỗi trục phát hoa đƣợc chọn ngẫu nhiên trên một cây xoài trƣởng thành (10 lần lặp lại, mỗi lần với 100 hoa lƣỡng tính), số trái rụng đƣợc đếm mỗi ngày, trong suốt 14 ngày đầu và mỗi tuần sau đó cho đến khi thu hoạch. % trái rụng đƣợc tính theo thời gian.
Một đợt trái đƣợc đánh dấu tiếp gồm 50 trái 14 ngày tuổi của 10 phát hoa, số trái rụng đƣợc đếm mỗi tuần cho đến khi thu hoạch. Phần trăm trái rụng đƣợc tính theo thời gian.
2.1.4. Theo dõi sự rụng theo tuổi trái
Các trái 0, 3, 7 và 10 ngày tuổi đƣợc đánh dấu. Theo dõi tốc độ rụng trái liên tiếp 3 ngày sau đó. Đánh giá phần trăm rụng tổng cộng.
Để theo dõi đợt rụng tiếp theo, các trái từ 2-8 tuần tuổi đƣợc đánh dấu. Theo dõi tốc độ rụng trái trong tuần kế tiếp. Đánh giá phần trăm rụng tổng cộng.
2.2. Sinh trắc nghiệm khúc cắt vùng rụng trái xoài để theo dõi tốc độ rụng và xác định thời rụng t50 và xác định thời rụng t50
Cắt 10 khúc cắt vùng rụng trái non xoài (dài 4 mm chứa vùng rụng ở giữa). Khử trùng bằng HgCl2 0,l % trong 5 phút. Đặt các khúc cắt trong Erlen 60ml chứa 10 ml môi trƣờng MS [56] lỏng đã đƣợc hấp tiệt trùng, (phụ lục 2.1) [52]. Lắc liên tục với tốc độ 80 vòng / phút, ở 28 ± 10 C, ánh sáng 2000 ± 200 lux, độ ẩm 85 ± 5% (hình 2.1). Theo dõi sự rụng xảy ra tại vùng rụng sau 18, 24, 42, 48, 66, 72, 90, 96 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Xác định thời rụng t50, tức thời gian cần thiết để có 50% khúc cắt tách rời tại vùng rụng [49].
Hình 2.1:Sơ đồ sinh trắc nghiệm khúc cắt vùng rụng trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.).
2.3. Quan sát hình thái giải phẫu
2.3.1. Các biến đổi hình thái của phôi và vùng rụng
Phôi trong trái ở các ngày tuổi khác nhau đƣợc giữ trong FAA (Phụ lục 2.2) và đƣợc cắt dọc qua vùng rụng theo thời gian. Quan sát sự biến đổi phôi và vùng rụng sau việc cắt mỏng bằng máy cắt vi phẫu và nhuộm.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 30 lần đối với mỗi tuổi trái và đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Thực vật, Đại học Maine, Cộng hòa Pháp.
2.3.2. Các biến đổi hình thái tại vùng rụng theo thời gian
2.3.2.1. Cấu trúc vùng rụng
Các khúc cắt vùng rụng trong trái xoài 7 ngày tuổi, sau khi khử trùng và nuôi cấy trong môi trƣờng MS (mục 2.2) sẽ đƣợc cắt ngang và quan sát dƣới kính
15
hiển vi qua sự nhuộm bằng dung dịch đỏ carmin và xanh iod [34]. 2.3.2.2. Các biến đổi về cấu trúc trong quá trình rụng
Các khúc cắt vùng rụng trong trái xoài 7 ngày tuổi (mục 2.2) sẽ đƣợc cắt dọc bằng máy cắt vi phẫu. Quan sát sự tan rã vách tế bào tại vùng rụng theo thời gian sau khi nhuộm.
2.3.3. Các biến đổi về cấu trúc vùng rụng dưới tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Lát cắt ngang lớp tế bào tại vùng rụng của các khúc cắt vùng rụng xoài, sau khi khử trùng, đƣợc đặt trong môi trƣờng MS dạng bán lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật: MA 2 mg/l, ABA 1mg/l, BA 1 mg/l. Quan sát sự tan rã vách tế bào theo thời gian tại vùng rụng dƣới kính hiển vi qua việc nhuộm bằng dung dịch đỏ carmin và xanh iod [34].
2.4. Khảo sát một số biến đổi sinh lí hóa học xảy ra tại vùng rụng của trái xoài ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau của phát hoa xoài ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau của phát hoa
Từ một số các kết quả trƣớc đó, khúc cắt vùng rụng của các trái non xoài 7 ngày tuổi đƣợc dùng để tìm hiểu các chỉ tiêu sinh hóa.
2.4.1. Cường độ hô hấp
Các khúc cắt vùng rụng nuôi trong môi trƣờng lỏng (mục 2.2) đƣợc đo cƣờng độ hô hấp bằng máy Hansatech của Anh. Sử dụng lo khúc cắt cho mỗi lần đo ở các thời điểm 0 giờ, trƣớc thời rụng 24 giờ, t50 và sau thời rụng 24 giờ . Kết quả là trung bình cộng của 3 lần lặp lại trên mỗi đối tƣợng.
2.4.2. Sự thoát khí etilen tại vùng rụng
Chuyển 0,5g khúc cắt vùng rụng trái non xoài sau khi nuôi cấy (mục 2.2) ở các thời điểm 0 giờ, trƣớc thời rụng 24 giờ, t50 và sau thời rụng 24 giờ vào trong các lọ nhỏ (thể tích 9 ml) có lót giấy thấm ẩm. Lọ đƣợc đậy nút kín và đặt chìm trong dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa để tránh sự khuếch tán khí etilen [37]. Sau 2
giờ, kể từ khi khúc cắt đƣợc đặt trong lọ kín, một mẫu khí 1 l đƣợc tách ra khỏi lọ. Hàm lƣợng etilen đƣợc đo bằng máy sắc kí khí tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh.
2.4.3. Hàm lượng RNA và protein tổng số
2.4.3.1. Li trích và đo RNA
Nghiền 0,5 g khúc cắt vùng rụng ở 0 giờ và t50 (mục 2.2) trong 4 lần thể tích etanol 950. Li tâm ở 2.000 g trong 10 phút. Bỏ phần nổi. Rửa phần cặn lần lƣợt với acid percloric pH 2 ở 00C, hỗn hợp metanol/ acid formic (10 ml metanol/ 1 giọt acid formic) (ở 00C), hỗn hợp ete/ etanol/ cloroform (2:2:1, v/v/v). Thủy giải trầm hiện với KOH 0,3N (18 giờ ở 370C). Điều chỉnh hỗn hợp về pH 2 với acid percloric. Li tâm ở 4000g trong 10 phút. Đo mật độ quang của phần nổi ở 260 nm và 290 nm. Hàm lƣợng RNA đƣợc tính theo công thức [22], [46], [70]:
RNA (mg/ml): (OD260 nm - OD290 nm ) x 0,048 2.4.3.2. Li trích và đo protein
Nghiền 1g khúc cắt vùng rụng ở 0 giờ và thời điểm t50 với 0,5 ml NaOH 0,5 N. Lọc qua giấy lọc đã đƣợc để trong lò nung 3000 C trong 2 giờ. Thêm vào mẫu 3 mi NaOH 0,5 N. Khuấy lên để trộn. Đậy bằng bi hoặc giấy nhôm. Đun cách thủy mẫu ở 1000C trong 10 phút. Làm lạnh mẫu. Li tâm ở 10.000 g trong 10 phút. Đo mật độ quang ở bƣớc sóng 562 nm. Tính hàm lƣợng protein so với đƣờng chuẩn [64].
2..4.4. Kiểm chứng tính nguyên vẹn của DNA trong quá trình rụng
Khúc cắt vùng rụng ở thời điểm 0 giờ và t50 (mục 2.2) đƣợc dùng để li trích DNA theo Ausubel 1999, Dellaporta et al. 1983) [25], [33]. Cách pha chế các dung dịch đƣợc trình bày trong phần phụ lục 2.3.
2.4.5. Biến đổi hàm lượng diệp lục tố xảy ra tại vùng rụng
17
12 giờ trong tối. Li tâm ở tốc độ 800 g trong 5 phút. Bỏ cặn. Đo mật độ quang ở 750nm, 664,5nm và 647 nm so với chuẩn là DMF.
Hàm lƣợng diệp lục tố a , b và tổng số đƣợc tính theo [42], [65]:
Kết quả là trung bình cộng của ba lần lặp lại với sai số chuẩn.
2.5. Đo hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
2.5.1. Li trích và phân đoạn
2g vật liệu tƣơi (trái non xoài) đƣợc li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992), Loveys và Van Dijk (1988), Meidner (1984) [14], [51], [54].
2.5.2. Sắc kí lớp mỏng
Dịch acid và trung tính (trong ete) của trái đƣợc chấm trên bản sắc kí lớp mỏng bằng nhôm tráng silica gel 60 F254 mã số 1.05554 (Merck). Dung môi di chuyển gồm chloroform, metanol và acid acetic (tỉ lệ 80:15:5 theo thể tích) [71]. Sau sự phân li ở 250C, bản silica gel đƣợc chia thành 10 băng bằng nhau (tính từ mực gốc đến vạch dung môi). Ngâm từng băng giấy sắc kí ƣơng nƣớc cất để có các dung dịch đƣợc dùng trong các sinh trắc nghiệm. Chuẩn là dịch trích chứa băng silica gel dƣới mực gốc.
2.5.3. Đo hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm
Các chất trích từ trái (ở các ngày tuổi khác nhau) ở 10 băng trên bản mỏng silica gel đƣợc cạo ra rồi ngâm trong nƣớc cất.
- Hàm lƣợng auxin và acid abcisic đƣợc đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) [47], [14]. Hàm lƣợng tổng cộng của auxin là tổng các tri số dƣơng. Hàm lƣợng tổng cộng các chất cản là tổng các tri số âm.
- Hàm lƣợng giberelin đƣợc đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách (
Lactuca sativa L.). Hàm lƣợng tổng cộng của giberelin là tổng các trị số dƣơng.
- Hàm lƣợng citokinin đƣợc đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dƣa leo (Cucumis satỉvus L.). Hàm lƣợng tổng cộng của citokinin là tổng các trị số dƣơng.
2.6. Sự thay đổi hoạt tính enzym liên quan trong sự rụng
Nghiền 1g khúc cắt vùng rụng trái non xoài ở thời điểm to và t50 trong 5 ml dịch đệm Tris HC1 với EDTA và NaCl ở 40C [54] (phụ lục 2.4). Để ổn định ở nhiệt độ lạnh (40C) trong lo phút. Li tâm ở 20.000g trong 20 phút. Lấy phần nổi. Thực hiện sinh trắc nghiệm trong aga với CMC (Phụ lục 2.4). Xác định đƣờng kính phân hủy CMC sau khi nhuộm I2KI 1% so với chuẩn chứa dung dịch cellulaz tinh khiết 0,5%.
2.7. Ảnh hưởng của các chất trích và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tinh khiết trên sự rụng của khúc cắt vùng rụng lá đậu (Dolichos sp.)
Hạt đậu (Dolichos sp.) đƣợc gieo trên cát ẩm vô trùng. Sau 7 ngày, khi cây mầm vừa có hai lá đầu tiên, cắt cô lập vùng rụng lá (Phụ lục 2.5). Đặt các khúc cắt vào becher 100 ml, trên 3 lớp giấy thấm chứa 2,5 ml nƣớc cất (Phụ lục 2.5) hay các dịch trích từ trái xoài ở các ngày tuổi khác nhau. Các dịch trích đƣợc xử lí gồm có pha acid, pha trung tính và chất ƣích thô (gộp từ hai pha trên, không qua sắc kí ) (mục 2.5.1), đƣợc điều chỉnh pH 5,7 và nhỏ mỗi ngày một giọt trực tiếp lên vùng rụng của khúc cắt. Đậy becher bằng giấy parafin. Điều kiện môi trƣờng từ khi gieo đậu đến khi kết thúc thí nghiệm: 28 ± l0
C, ánh sáng 2000 ± 200 lux độ ẩm 85 ± 5%. Mỗi xử lí đƣợc thực hiện trên 10 khúc cắt vùng rụng, 3 lần lặp lại, chuẩn là nƣớc cất. Xác định t50 ở mỗi xử lí, tính sai biệt so với chuẩn và so với các chất điều hòa sinh trƣởng MA 2 mg/l, AAB 2 mg/l, GA3 20 mg/l và BA 1mg/l.
19
2.8. Ảnh hưởng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tinh khiết trên sự rụng của khúc cắt vùng rụng trái xoài
Đặt 10 khúc cắt vùng rụng xoài trong Erlen 60 ml, chứa 10 ml môi trƣờng MS lỏng, có bổ sung các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật: GA3 20 mg/l, AIA 2 mg/l và 5 mg/l, AIA 5 mg/l và zeatin 10 mg/l, zeatin 10 mg/l, ethrel 1000 mg/l và AAB 1 mg/l. Chỉnh dung dịch về pH 5,7. Các Erlen đƣợc lắc trên máy lắc với tốc độ 80 vòng/phút, nhiệt độ 28 ± 10 C, ánh sáng 2000 ± 200 lux, độ ẩm 85 ± 5%. Sự rụng đƣợc kiểm tra sau 48, 66, 72, 90, 96, 114, 120, 142, 148 giờ và thời rụng t50 đƣợc đánh giá so với chuẩn. Kết quả là trung bình cộng của 3 lần lặp lại.
2.9. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật để kiểm soát sự rụng trái non trên cây xoài
Các xử lí ngoài thiên nhiên đƣợc thực hiện tại vƣờn trồng xoài Cát Hòa Lộc của Trại Giống Cây Trồng Đồng Tiến-Hốc Môn. Các chất và hỗn hợp xử lí đƣợc phun trực tiếp lên trái ở các giai đoạn tuổi khác nhau. Trái đƣợc xử lí 2 ngày một lần, vào khoảng 16 giờ. Mỗi nghiệm thức xử lí đƣợc thực hiện trên 5 cây khác nhau. Trên mỗi cây chọn ngẫu nhiên 10 phát hoa. Trên mỗi phát hoa chọn 20 hoa lƣỡng tính (trái 0 ngày tuổi) hay trái non. Nói cách khác, mỗi lần xử lí trên 20 hoa lƣỡng tính hay trái non, 50 lần lặp lại.
Có hai đợt xử lí:
- Đợt 1 vào tháng 1/2001: trái đƣợc phun 3 lần và kết quả đƣợc quan sát ở ngày 7 kể từ lần phun thứ nhất.
- Đợt 2 vào tháng 1/2002: trái đƣợc phun 2 ngày một lần, trong vòng 8 tuần. Sau đó, ở tuần 14, trái đƣợc thu hoạch để xác định phần trăm rụng.
20
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Kết quả
3.1. Theo dõi sự tăng trưởng trái và hiện tượng rụng ngoài thiên nhiên
3.1.1. Sự ra hoa và tăng trưởng trái
Xoài Cát Hòa Lộc, trồng tại trại Giống Cây trồng Đồng Tiến, bắt đầu ra hoa từ cuối tháng 11 hàng năm, và đến khoảng tháng giêng hoa bắt đầu nở rộ
Hoa xoài nở không đồng loạt. Một phát hoa có trên 4.000 hoa. Hoa xoài nhỏ, màu trắng, hơi ửng vàng, gồm 5 cánh. Có hai loại hoa: hoa đực và hoa lƣỡng tính. Hoa đực có 5 nhị. Hoa lƣỡng tính có 5 nhị và 1 nhụy, trong đó chỉ có một nhị mang bao phấn lớn. Tỉ lệ hoa đực trên trục khá nhiều. Hoa lƣỡng tính thƣờng nằm giữa một xim của ba hoa hoặc nằm ở