Sau sự điện di trên gel agaroz 1,5%, DNA từ khúc cắt vùng rụng trái non xoài 7 ngày tuổi xuất hiện rõ trong một băng ở gần mực gốc, ở to hay t50 (62,8 giờ) (trƣờng hợp không có xử lí Hind III).
Khi xử lí bằng enzym giới hạn Hind III, DNA của tế bào vùng rụng bị cắt để cho ba băng khác nhau. Cả ba băng này đều có vị trí tƣơng ứng giống nhau ở to và t50 (ảnh 3.22).
3.4.4. Biến đổi hàm lượng diệp lục tố xảy ra tại vùng rụng
Diệp lục tố a liên tục giảm từ 0 - 86 giờ, trái lại, diệp lục tố b giảm tại thời rụng (62,8 giờ) nhƣng lại tăng nhẹ sau đó. Tuy nhiên, hàm lƣợng diệp lục tố tổng số lại giảm đều trong suốt quá trình rụng (bảng 3.5).
Ảnh 3.22: Chất trích DNA từ vùng rụng trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) được điện di trên gel agaroz.
Bảng 3.5: Hàm lượng diệp lục tố (đơn vị: Mg/ml) trong khúc cắt vùng rụng trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) 7 ngày tuổi theo thời gian.
Diệp lục tố
Thời điểm (giờ)
0 39 62,8 86
a 3,59 + 0,51 3,42 ±0,12 1,70 ±0,07 1,46 ±0,24
b 2,89 ±0,12 2,34 ± 0,05 0,49 ± 0,04 0,87 ±0,17 a+b 6,77 ± 0,42 5,76 ± 0,07 3,18 ±0,09 2,33 ±0,21
40
3.5. Hàm lượng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Hàm lượng của auxin trong trái ở các ngày tuổi khác nhau
Chất trích từ trái 0 ngày tuổi sau khi sắc kí và sinh trắc nghiệm cho thấy hàm lƣợng cao của MA (chất trích từ Rf 0,82-0,85) và auxin tổng số. Hàm lƣợng auxin giảm mạnh ở trái 3 và 7 ngày tuổi, sau đó tăng trở lại ở trái 10 ngày tuổi (hình 3.7).
Hàm lượng của chất cản trong trái ở các ngày tuổi khác nhau
ở các trái 3, 7 hay 10 ngày tuổi đều có hàm lƣợng AAB (chất trích từ Rf 0,95-0,98) và chất cản tổng cộng tăng cao so với trái 0 ngày tuổi. Hàm lƣợng này đặc biệt cao ở trái 3, 7 ngày tuổi và sau đó giảm dần cho tới trái 10 ngày tuổi (hình 3.8).
Hàm lượng của giberelin trong trái ở các ngày tuổi khác nhau
Hàm lƣợng giberelin ở vị trí GA3 (Rf 0,45-0,49) và giberelin tổng số cao ở trái 0 ngày tuổi, sau đó giảm mạnh ở trái 3, 7 và 10 ngày tuổi (hình 3.9).
Tuồi trái (ngày)
Hình 3.8: Sự thay đối hàm lượng chất cản trong trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) theo tuổi trái.
Tuổi trái (ngày)
Hình 3.9: Sự thay đổi hàm lượng giberelin trong trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) theo tuổi trái.
Hàm lượng của citokinin trong trái ở các ngày tuổi khác nhau
Tƣơng tự trƣờng hợp của auxin hoặc giberelin, hàm lƣợng của zeatin (chất trích từ Rf 0,66-0,69) và citokinin tổng số tăng cao ở trái 0 ngày tuổi, sau đó giảm mạnh ở trái 3 và 7 ngày tuổi, và tăng nhẹ ở trái 10 ngày tuổi (hình 3.10).
42
Hình 3.10: Sự thay đổi hàm lượng citokinin trong trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) theo tuổi trái.
Để so sánh sự thay đổi hàm lƣợng của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật trong trái ở các ngày tuổi khác nhau, sau khi sắc kí, các kết quả đƣợc tóm tắt trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: So sánh hàm lượng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (sau khi sắc kí) trong trái xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) ở các ngày tuổi khác nhau
Tuổi trái ( ngày) 0 3 7 10 AIA Auxin tổng AAB Chất cản tổng Giberelin Giberelin tổng Citokinin Citokinin tổng
tƣơng đƣơng (tăng giảm không đáng kể) tăng
giảm
Đối với các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật của trái đƣợc tính từ các băng sắc kí tƣơng ứng, nhìn chung, nếu hàm lƣợng auxin, giberelin và citokinin thấp ở ngày 7 (khi trái dễ rụng), thì hàm lƣợng acid abcisic rất cao ở ngày này so với ở các ngày 0 và 3 trƣớc đó (khi trái rất ít rụng) (bảng 3.6).
3.6. Sự thay đổi hoạt tính enzym cellulaz
Sự thay đổi đƣờng kính vòng phân hủy carboxymetilcelluloz cho thấy hoạt tính của cellulaz ở các khúc cắt vùng rụng trái xoài (trong sinh trắc nghiệm với môi trƣờng MS 1/2) gia tăng ở thời rụng (62,8 giờ) so với thời điểm 0 giờ (bảng 3.7, ảnh 3.23).
Bảng 3.7: Đường kính vòng phân hủy carboxymetilcelluloz từ chất trích của khúc cắt vùng rụng trái xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) 7 ngày tuổi.
Chất trích cellulaz Đƣờng kính vòng phân hủy (cm)
Chuẩn (0,5%) 3,5 ± 0,0
t0 2,7 ± 0,0
44
Ảnh 3.23: Sự gia tăng hoạt tính cellulaz tại vùng rụng của trái xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) 7 ngày tuổi.
1/ Hoạt tính cellulaz tại vùng rụng ở thời điểm to
2/ Hoạt tính cellulaz tại vùng rụng ở thời điểm t50 (62,8 giờ) 3/ Hoạt tính cellulaz chuẩn (0,5%)
3.7. Ảnh hưởng của các chất trích từ trái xoài trên sự rụng của khúc cắt vùng rụng lá đậu (Dolichos sp.)
Chất trích thô từ trái xoài ở các ngày tuổi khác nhau (gộp chung pha acid và pha trung tính sau khi trích, không qua sắc kí), pha acid và pha trung tính riêng rẽ đƣợc dùng trong sinh trắc nghiệm trên khúc cắt vùng rụng lá đậu (Dolichos sp.). Sai biệt t50 so với chuẩn cho thấy, cả 3 dạng chất trích ở các trái xoài 0 ngày tuổi đều cản mạnh sự rụng của khúc cắt vùng rụng lá đậu; hiệu ứng cản của trái 3 ngày tuổi chỉ có ở pha trung tính. Tƣơng tự, chỉ có pha acid của trái 7 ngày tuổi cản sự rụng. Chất trích từ trái 10 kích thích sự rụng, (hình 3.11).
Hình 3.11: Sai biệt t50 của khúc cắt vùng rụng lá đậu (Dolichos sp.) do xử lý chất trích thô, pha acid và pha trung tính từ trái xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.) ở các ngày tuổi khác nhau.
3.8.Ảnh hưởng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tinh khiết trên sự rụng của khúc cắt vùng rụng trái xoài
Trong sinh trắc nghiệm khúc cắt vùng rụng trái xoài 7 ngày tuổi, môi trƣờng MS 1/2 dạng lỏng có bổ sung MA 2 mg/l, AIA 5 mg/l, Zeatin 10 mg/l hoặc AIA 5 mg/l kết hợp với Zeatin 10 mg/l đều có tác dụng kéo dài thời rụng (cản sự rụng), trong khi GA3 20 mg/l, ethrel 1000 mg/l và ABA 1 mg/l kích thích sự rụng (Hình 3.12).
46
Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật
Hình 3.12: Sai biệt t30 của khúc cắt vùng rụng trái non xoài Cát Hoa Lộc (Mangifera indica L.) 7 ngày tuổi dưới ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tinh khiết.
3.9. Ấp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật để kiểm soát sự rụng trái non trên cây xoài
Các chất điều hòa tảng trƣởng thực vật đƣợc xử lí trên trái cho kết quả rất khác nhau ở các ngày tuổi khác nhau:
- MA 2 mg/l giúp tăng tỉ lệ đậu trái (cản sự rụng) ở trái 3 ngày tuổi, nhƣng kích thích sự rụng ở trái 7 ngày tuổi. AIA 5 mg/l cản sự rụng ở tất cả các trái 0-10 ngày tuổi, đặc biệt là có khả năng cản mạnh sự rụng (tăng tỉ lệ đậu trái) khi trái ở giai đoạn dễ rụng (7 ngày tuổi).
- Zeatin 10 mg/l giúp tăng sự đậu trái (cản sự rụng) ở tất cả các trái 0-10 ngày tuổi, và hiệu ứng đặc biệt mạnh khi kết hợp với MA 5 mg/l trên trái 7 ngày tuổi. Tuy nhiên, hiệu ứng cản sự rụng giảm đi ở các trái 0 và 10 ngày tuổi (ở giai đoạn trái ít rụng).
- GA3 nói chung có tác dụng làm tăng đậu trái ở ngày 3 và kích thích nhẹ sự rụng (các ngày 7 và 10) (bảng 3.8).
Bảng 3.8: Tỉ lệ đậu trái (%) sau 7 ngày xử lí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên trái ở các ngày tuổi khác nhau để kiểm soát sự rụng trái non xoài Cát Hoa Lộc (Mangifera indica L.) ngoài thiên nhiên (tháng
1/2001).
Tuổi trái ( ngày)
Chất xử lí 0 3 7 10 Chuẩn 13,87 ±2,17 9,31 ± 1,73 6,72 ± 1,13 11,41 ± 2,26 MA 2 mg/l 13,33 ± 1,22 16,81 ± 1,98 4,21 ± 1,67 16,17 ± 1,54 MA 5 mg/l 28,07 ± 1,34 19,23 + 0,19 20,94 ± 1,43 25,25 ± 2,26 AIA 5 mg/l và Zeatin 10 mg/l 15 ,89 ±1,34 22,92 ± 3,73 33,75 ±6,41 16,26 ± 1,32 Zeatin 10 mg/l 17,35 ± 1,47 15,75 ± 1,20 10,26 ± 1,00 22,75 ±3,21 GA3 20 mg/l 13,34 ± 1,01 17,84 ± 1,87 5,77 ± 1,25 9,07 ± 2,66 Từ các kết quả xử lí đƣợc trình bày trong bảng 3.8, một số dung dịch chứa các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật có thành phần và tì lệ khác nhau đƣợc xử lí khá dài trên trái (8 tuần). Hiệu ứng cản sự rụng (giúp sự đậu trái) đƣợc trình bày trong bảng 3.9. Tất cả các dung dịch xử lí đều giúp sự đậu trái, cản mạnh sự rụng trái, đặc biệt là các dung dịch A5, c50 và D10 , trừ dung dịch F5 chỉ làm tăng nhẹ tỉ lệ đậu trái.
48
Bảng 3.9: Kết quả xử lí dung dịch chứa các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhằm kiểm soát sự rụng trái non xoài Cát Hoa Lộc (Mangifera indica L.) ngoài thiên nhiên (tháng 1/2002)
Chất xử lí Chuẩn A5 B5 C50 D10 C40D10 F5 % đậu trái 10,22 ± 1,36 43,53 ±3,15 33,64 ±3,04 40,63 ±2,87 45,21 ±3,03 35,12 ±4,21 16,23 ±3,63
Thảo luận
Về thời điểm xảy ra hiện tượng rụng trái non xoài và cơ quan quyết định hiện tượng này
Trái xoài tăng trƣởng theo đƣờng cong hình chữ S kép. Ngoài giai đoạn tăng trƣởng chậm lúc khởi đầu sự tăng trƣởng trái trong hai tuần đầu, giai đoạn tăng trƣởng chậm thứ hai bắt đầu từ tuần 10 tới tuần 11 ở giữa hai lần tăng trƣờng nhanh. Tuy nhiên, chính trong giai đoạn tăng trƣởng chậm thứ hai này, phôi (hợp tử) đạt trọng lƣợng ở mức cao nhất. Sự tăng trƣởng của trái xoài nhƣ vậy rất giống với sự tăng trƣởng của một trái có nhân điển hình [32].
Sự rụng trái xoài xảy ra rất sớm, ngay từ giai đoạn đầu trong quá trình tăng trƣởng của phát hoa, lúc chỉ có vài trái non trên mỗi nhánh thứ cấp cho đến khi phát hoa đạt kích thƣớc tối đa (bảng 3.2). Tỉ lệ rụng trái non rất cao, hơn 96%, tập trung trong 2 tuần đầu sau khi hoa nở (hình 3.2). Trong đó, sự rụng xảy ra mạnh ở trái 7 ngày tuổi (bảng 3.3). Tiếp theo, còn một đợt rụng thứ hai, cũng với tỉ lệ rụng khá cao, chủ yếu ở trái 3 tuần tuổi (hình 3.3).
Nhƣ vậy, có sự liên hệ chặt chẽ giữa tuổi trái và sự rụng trái. Điều này cho thây trái, hột và phôi trong hột trong quá trình tăng trƣởng có vai trò đặc biệt trong sự rụng của chính trái [17], [43], [67], [68].
So sánh sự rụng trái non với đƣờng cong tăng trƣởng trái (hình 3.1); ta thấy sự rụng trái non xoài Cát Hòa Lộc tập trung trong giai đoạn tăng trƣởng chậm của trái (đợt 1) và khi trái bắt đầu vào giai đoạn tăng trƣởng nhanh (đợt 2). Trong cả hai giai đoạn này, phôi còn rất nhỏ, ƣong khi hột và vỏ hột tăng trƣởng sớm hơn và đƣợc ghi nhận rõ từ tuần thứ 3 (bảng 3.1). Trong vỏ và trong hột thƣờng có chứa nhiều chất cản [11], [15].
Khi sự tăng trƣờng của phôi nhanh và bắt đầu đƣợc ghi nhận từ tuần thứ 5, sự rụng bắt đầu giảm mạnh. Rõ ràng phôi khi xuất hiện trong hột và tăng trƣởng
50
sẽ trở thành một trung tâm kiểm soát quan trọng các hiện tƣợng sinh lí học xảy ra trong cây, trong đó có hiện tƣợng rụng [26].
Hiện tƣợng phôi bị trụy tƣơng ứng với sự tan rã tế bào vùng rụng (ảnh 3.3) một lần nữa cho thấy vai trò của phôi trong sự rụng. Hoa không thụ phấn noãn bị hƣ và túi phôi bị thoái hóa ở xoài Haden (ở Horida) đƣợc chứng minh có liên quan tới sự rụng trái non xoài [30], [45].
Về các thay đối hình thái và sự lão suy xảy ra tại vùng rụng
Sự rụng ở trái xoài chỉ xảy ra tại vùng rụng trái. Vùng này chứa ít tế bào hóa cƣơng mô so với vùng cuống ỏ phía trong vùng rụng (ảnh 3.4, 3.5, 3.6). Vùng rụng có vẻ yếu ớt về mặt cấu trúc, tuy nhiên, sự rụng không phải do tính "yếu ớt" này mà do một quá trình sinh lí đặc sắc do gen điều khiển và chịu sự tác động của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật [48].
Trên lát cắt dọc, ta thấy dƣờng nhƣ sự rụng bắt đầu từ phía ngoài của vùng rụng đi vào, nhƣng trên lát cắt ngang thể hiện rõ sự tan rã vách tế bào hoặc sự kém bắt màu của vách tế bào bắt đầu từ lớp tế bào ở trong cùng của vùng nhu mô vỏ, bên cạnh túi tiết (ảnh 3.17, 3.20). Các túi tiết này chứa nhiều mangiferol (sesquiterpen alcol). Terpen là lipid đƣợc tổng hợp từ acetyl CoA theo con đƣờng acid mevalonic. Đây cũng là con đƣờng tổng hợp acid abcisic [11], [15], [62], chất kích thích trong sự rụng.
Cũng trên các lát cắt dọc, ta thấy vùng rụng xuất hiện rất sớm trƣớc quá trình tách rời tế bào (ảnh 3.7 đến 3.15). Sự tan rã vách tế bào dẫn tới sự rụng trái non xoài Cát Hòa Lộc do đó không liên quan tới hoạt động của lớp tế bào mô phân sinh tƣơng tự nhƣ sự rụng trái non ở tiêu [13] và các trái khác [20].
Hàm lƣợng diệp lục tố của vùng rụng giảm đều trong quá trình rụng. Vùng rụng trái không phải là cơ quan quang hợp của cây. Sự mất diệp lục tố là một trong các biểu hiện nổi bật của quá trình lão suy và mức độ phân hủy diệp lục tố
thƣờng đƣợc xem nhƣ tiêu chuẩn tin cậy để đánh giá quá trình này. Việc giảm liên tục hàm lƣợng diệp lục tố a trong mô vùng rụng cho thấy một cách chắc chắn mức độ lão suy cao của vùng này [59].
Về sự gia tăng cường độ hô hấp và sản xuất khí etilen tại vùng rụng
Sự thoát khí etilen tại vùng rụng trƣớc thời điểm t50 kéo theo sự gia tăng cƣờng độ hô hấp tới một đỉnh ở 62,8 giờ trong quá trình rụng (hình 3.6). Các sự kiện này chứng tỏ hoạt động biến dƣỡng tích cực của các tế bào vùng rụng trong quá trình tan rã vách tế bào. Sau khi sự rụng xảy ra, sự sản xuất etilen và cƣờng độ hô hấp giảm mạnh. Etilen đóng vai trò quan trọng trong sự lão suy và sự rụng ở thực vật [11], [60].
Về con đường sinh học phân tử (sự biểu hiện gen) trong quá trình rụng
Sự kiện hàm lƣợng RNA, protein gia tăng trong vùng rụng trƣớc sự rụng và đạt tới đỉnh ở thời rụng t50 đã đƣợc ghi nhận [13], [39]. Sự gia tăng này do sự tổng hợp một hay nhiều protein liên quan đến lão suy và sự rụng, mặc dù trong tình trạng luôn luôn có sự phân giải protein. Để có sự gia tăng tổng hợp protein ở 62,8 giờ (t50), sự gia tăng tổng hợp RNA đã xảy ra trƣớc đó ở 0-39 giờ. Sự giảm hàm lƣợng protein trong giai đoạn 0-39 giờ không chỉ liên quan đến sự phân hủy protein, bởi vì, có sự tổng hợp nhiều polypeptid đặc trƣng, nhƣng cũng có sự mất đi một số polypeptid đặc trƣng khác [39]. Nói cách khác, có sự mất cân bằng giữa tỉ lệ protein tạo mới và protein bị phân hủy. Sự giảm hàm lƣợng protein trong giai đoạn 0-39 giờ còn là chỉ thị của quá trình lão hóa cần thiết cho hoạt động của etilen ƣong sự cảm ứng các enzym phân hủy vách tế bào.
Sinh trắc nghiệm với CMC (carboxymetilcelluloz) và dịch trích enzym từ vùng rụng cho thấy hoạt tính cellulaz gia tăng ở thời điểm 62,8 giờ (t50) (ảnh 3.23). Nhờ đó, các vi sợi celluloz của vách tế bào bị thủy giải. Cùng với cellulaz, polygalacturonaz cũng góp phần phân hủy vách tế bào vùng rụng
52
do hoạt động xúc tác sự thủy giải các hợp chất pectic [39].
Trong quá trình rụng, DNA của vùng rụng xoài hầu nhƣ còn nguyên vẹn: các băng đều xuất hiện ở cùng vị trí, dù có đƣợc cắt bằng enzym giới hạn hay không (ảnh 3.22). Kết quả này phần nào chứng tỏ sự rụng là hiện tƣợng sinh lí do gen điều khiển qua chuỗi sinh tổng hợp protein.
Về sự thay đổi và vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong trái
Đối với các chất trích sau sự sắc kí trên bản mỏng silicagel, các sinh trắc nghiệm chuyên biệt cho thấy auxin (AIA cũng nhƣ AIA tổng số) giảm mạnh trong trái 3 và 7 ngày tuổi, nhƣng lại tăng cao trong trái 10 ngày tuổi (bảng 3.6).
Rubinstein và Leopold (1963) cho rằng: "nồng độ auxin hiện diện tại vùng rụng (không phải khuynh độ auxin qua vùng rụng) kiểm soát sự rụng" [61]. Theo quan điểm này, sự rụng là một quá trình sinh lí bình thƣờng, đƣợc kích thích bởi auxin ở các nồng độ thấp, nhƣng bị cản bởi auxin ở các nồng độ cao. Do đó, sự giảm auxin trong trái xoài Cát Hòa Lộc ở các ngày 3 và 7 đã dẫn tới sự giảm auxin trong vùng rụng và do đó dẫn tới sự rụng.
Trái với auxin, acid abcisic và các chất cản nói chung tăng cao trong trái ở ngày 3 (ngay trƣớc khi trái rụng nhiều) và ở ngày 7 (khi trái rụng nhiều). Sau đó, hàm lƣợng acid