Có ít nhất ba quan điểm về mối liên hệ giữa hiện tƣợng lão suy và rụng:
- Sự rụng là hiện tƣợng lão suy đặc biệt, lão suy tế bào cục bộ (localized cellular senescence) [63]. Khi tế bào vùng rụng lão suy, màng tế bào trở nên thấm, do đó có sự di chuyển vào thân các muối khoáng và các hợp chất hữu cơ
đƣợc thủy giải từ protein và tinh bột để tái sử dụng [41].
- Sự lão suy có vai trò khởi phát quá trình rụng do sản xuất "yếu tố lão suy" [43], yếu tố ấy là acid abcisic [36] hay một số acid amin [61]. Theo Abeles (1967) [19] vai trò khởi phát ấy do sự lão suy là điều kiện cần thiết để etilen, chất có vai trò trung tâm trong sự rụng, hoạt động kích thích sự rụng.
- Sự lão suy và sự rụng là những quá trình độc lập, xảy ra đồng thời [21]. 1.5.4.2. Hiện tƣợng tƣơng quan giữa vùng rụng vứi các cơ quan khác
Sự tƣơng quan là sự lệ thuộc về hoạt động chức năng giữa những cơ quan trong cùng một cơ thể thực vật [40]. Hiện tƣợng này thƣờng do các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật kiểm soát. Trong sự rụng, các tƣơng quan sau đây thƣờng đƣợc đề cập:
- Lá hay trái có vai trò quan trọng hàng đầu kiểm soát sự phát triển lớp tách rời của lá hay trái đó [17], [43].
- Các lá non và chồi ngọn đang tăng trƣởng kích thích sự phát triển lớp tách rời ở các cuống lá bị cắt bỏ phiến lá [43].
- Các trái đậu già Phaseolus kích thích sự rụng hoa và trái non xuất hiện sau [67]. 1.5.4.3. Sự hô hấp
Sự tạo các enzym phân hủy vách kéo theo sự tăng nhanh quá trình hô hấp ở những tế bào gần vùng rụng. Quá trình hô hấp tăng cao và đạt đỉnh tƣơng ứng với sự rụng [62].
1.5.4.4. Hoạt động của con đƣờng sinh học phân tử
Quan điểm mỗi gen điều khiển sự hoạt động của một enzym chuyên biệt theo trình tự: DNA - mRNA - polypeptid đƣợc thừa nhận hiện nay [16].
Rụng là một quá trình đƣợc mã hóa trong gen, xảy ra tại vùng rụng, bao gồm nhiều bƣớc kế tiếp nhau: các yếu tố môi trƣờng hay sự mất cân đối của các
8
chất điều hòa tăng trƣởng thực vật dẫn đến sự sao chép, tổng hợp mới enzym thủy giải và sự tan rã vách tế bào tại vùng rụng [59].
1.5.5. Sự biến đổi enzym trong vùng rụng
Trong sự rụng, có sự gia tăng hoạt tính pectinaz và cellulaz đồng thời có sự giảm hoạt tính pectin metil esteraz (PME).
1.6. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự rụng
1.6.1. Vai trò của auxin
Có nhiều quan điểm về vai trò của auxin trên sự rụng:
- Vị trí áp dụng auxin kiểm soát sự rụng
Addicott và Lynch (1951), cùng một nồng độ, auxin áp dụng "xa" ức chế sự phát triển của vùng rụng, nhƣng áp dụng "gần" kích thích sự rụng vì auxin không thể di chuyển nhanh tới vùng rụng để cản sự rụng [19].
- Thuyết về "khuynh độ auxin" (auxin gradient)
Trong thiên nhiên, lá đang tăng trƣởng và trƣởng thành sản xuất đủ auxin, khiến khuynh độ auxin ngang qua vùng rụng cao ở vị trí xa nên sự rụng lá không xảy ra và ngƣợc lại [19], [29].
- Auxin trong phiến lá là yếu tố bình thường cản sự rụng lá
Theo Wetmore và Jacobs (1953)[43]. Lá là đơn vị sinh lí độc lập của hiện tƣợng rụng lá [44]. Sự cắt bỏ phiến lá thúc nhanh sự rụng của cuống lá còn lại.
- Cân bằng "auxin - auxin" kiểm soát sự rụng
Không thể xem lá là đơn vị sinh lí độc lập trong quá trình rụng: Khi luồng auxin từ phiến lá giảm tới mức nào đó, auxin từ nụ ngọn hay các lá đang tăng trƣởng di chuyển tới vùng rụng của các lá già hơn phía dƣới và kích thích quá trình rụng tại đây. Các hoa có thể thúc sự rụng của trái hay hoa khác trên cùng một cây theo cách này [43], [44]. Khi đó, auxin đóng vai trò "dấu hiệu tƣơng quan" và di chuyển tới các mô đích vùng rụng, kích thích sự tạo "chất cản tƣơng
quan" tại đây. "Chất cản tƣơng quan" này là acid abcisic, chất có vai trò kích thích sự rụng [67].
- Nồng độ auxin kiểm soát sự rụng
Trên các khúc cắt vùng rụng, auxin ở các nồng độ thấp kích thích nhƣng ở các nồng độ cao cản sự rụng, bất kì xử lí "gần" hay "xa" [43].
- Thời điểm áp dụng auxin kiểm soát sự rụng
Quan điểm về thời điểm áp dụng auxin có ý nghĩa quan trọng: hàm lƣợng auxin di chuyển tới vùng rụng, tự nó, không liên quan gì đến phản ứng rụng, chính trạng thái sinh lí của vùng rụng lúc áp dụng auxin mới là điều quan trọng [61].
1.6.2. Vai trò của citokinin
Cũng nhƣ auxin, citokinin cản sự rụng do cản sự lão suy tế bào - trạng thái cần thiết để etilen hoạt động kích thích sự rụng, dù auxin và citokinin đều thúc sự tỏa khí etilen[19].
1.6.3. Vai trò của giberelin
Trên các khúc cắt vùng rụng đậu và bông vải, dù xử lí "xa" hay "gần", giberelin đều kích thích sự rụng, ngay cả khi áp dụng đồng thời với AIA [44]. Lewis và Bakhshi (1968) [50] chứng minh rằng cân bằng giberelin / auxin, chứ không phải hàm lƣợng tuyệt đối của mỗi chất, kiểm soát sự rụng.
1.6.4. Vai trò của acid abcisic
Trên các khúc cắt vùng rụng bông vải, acid abcisic đƣợc áp dụng "xa" hay "gần" đều kích thích sự rụng. Đây là "yếu tố lão suy" khởi phát sự rụng. Tuy nhiên, lá nguyên ít nhạy cảm với acid abcisic [44].
1.6.5. Vai trò của etilen
Hầu nhƣ các mô thực vật đều sản xuất khí etilen. Etilen đƣợc chứng minh có vai trò trung tâm trong sự rụng [19]. Nếu đƣợc thông khí tốt, nồng độ etilen bên trong mô tỉ lệ trực tiếp với tốc độ sản xuất hay thoát chất khí này khỏi mô [28].
10
1.7. Cây xoài và các nghiên cứu liên quan
1.7.1. Cây xoài
Cây xoài thuộc:
- Ngành : Magnoliophyta - Lớp : Magnoliopsida - Phân lớp : Rosidae - Bộ : Rutales - Họ : Anacardiaceae - Chi : Mangifera - Loài : indica
- Tên khoa học: Mangifera indica L. [1], [3], [9].
Xoài là cây ăn trái vùng nhiệt đới, đƣợc biết nhiều trong các nƣớc công nghiệp [57]. Cây thân gỗ, sống tới 300- 400 năm [12]. Xoài có thể trồng từ hột (sẽ lâu cho trái hơn) hoặc bằng cách chiết cây.
Tại các vùng đồng bằng sông Cửu Long, xoài ra hoa từ tháng 12 đến tháng 3 dƣơng lịch, ở miền Bắc sớm hơn một chút [2]. Trƣớc khi ra hoa, xoài cần thời gian khô khoảng 2 tháng để hình thành mầm hoa. Khi ra hoa, cây hết sức kị mƣa vì trái không đậu đƣợc [2]. Cây xoài chịu đƣợc nhiệt độ từ 4-10°C đến 46°c, nhƣng tốt nhất ở 24-27°C. Nhiệt độ cao gây hại cho sự sinh trƣởng của cây, nếu ẩm độ không khí thấp [6]. Xoài thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng, có thể tự thụ nhƣng khó cho trái.
Dù có khả năng chịu hạn, xoài rất cần nƣớc để cho sản lƣợng cao. Sản lƣợng xoài tƣơng quan chặt với lƣợng mƣa hằng năm [6]. Một trong những nguyên nhân làm cho xoài kém đậu trái là thời gian tiếp nhận hạt phấn chỉ trong vài giờ. ở xoài, nhụy thƣờng chín trƣớc. Thời gian tốt nhất để nhụy có thể tiếp nhận hạt phấn là vào khoảng mặt trời mọc, trong khi đó nhị tung phấn vào khoảng 8-10 giờ
sáng. Điều này đã cản trở sự thụ phấn, thụ tinh ở xoài [12].
1.7.2. Các nghiên cứu liên quan
Xoài là loại trái có giá trị xuất khẩu cao. Do đó, nhiều nƣớc quan tâm nghiên cứu cây xoài về nhiều mặt. Từ 6-9 tháng 4 năm 1999, tại Thái Lan đã tổ chức Hội nghị quốc tế chuyên đề về Xoài lần thứ VI, gồm 189 khách tham dự từ Thái Lan và 156 khách đến từ 29 nƣớc khác. Hội nghị đã có các báo cáo liên quan về việc sử dụng paclobutrazol để kích thích ra hoa (An Độ), tăng năng suất với acid boric 1,5% phun trên phát hoa (Israel), làm thế nào để đạt năng suất cao (Nam Phi), sự ra hoa (úc),... Một số nghiên cứu về bảo vệ cây nhƣ tính nhạy cảm của sự thụ tinh ở hoa xoài (Đài Loan), kiểm soát sinh học các loài côn trùng, bọ cánh cứng (Nam Phi),...Đặc biệt là các nghiên cứu về công nghệ sinh học và chƣơng trình tạo giống ở xoài nhƣ phát triển ngân hàng gen xoài của vƣờn nhiệt đới Fairchild (Mỹ, Ấn Độ, úc), hóa phân loại học (chemotaxonomy) các Mangifera spp. và khả năng tạo giống xoài trong tƣơng lai (Thái Lan và Nhật), khả năng sử dụng bản đồ phân tử để tạo giống xoài, gen đánh dấu, tạo dòng, bản đồ gen, kĩ thuật di truyền. Thành công trong sự đƣa DNA lạ vào gen xoài (úc, Brazil) cho thấy trái xoài lai rất nhỏ có khả năng kháng nấm bệnh [66]. Trong Hội nghị, các nghiên cứu về sự rụng hoa và trái non chƣa thấy đƣợc đề cập. Tuy nhiên, Thái Lan đã nghiên cứu hiện tƣợng này trên các giống xoài khác nhau của Thái. Riêng tại Việt Nam, chƣa thấy có công bố tài liệu nào nghiên cứu về sinh lí trên sự rụng trái non xoài.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP
Vật liệu
+ Trái xoài (Mangifera indica L., giống trồng Cát Hòa Lộc) ở 0 3 7 10 ngày tuổi , từ các cây xoài ghép trƣởng thành 5 năm tuổi đƣợc trồng tại Trại Giống Cây Trồng Đồng Tiến - Hốc môn (TP Hồ Chí Minh).
+ Khúc cắt vùng rụng trái non xoài (Mangifera indica L., giống trồng Cát Hòa Lộc), ở ngày tuổi thứ 7.
+ Khúc cắt vùng rụng lá của cây mầm đậu (Dolichos sp.) 7 ngày tuổi (kể từ khi nảy mầm).
+ Khúc cắt diệp tiêu của cây mạ lúa (Oryza sativa L.) 72 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
+ Trụ hạ diệp của cây mầm xà lách (Lactuca sativa L) 18 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
+ Tử diệp của cây mầm dƣa leo (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm).
Phương pháp
2.1. Theo dõi sự tăng trưởng trái và hiện tượng rụng ngoài thiên nhiên
2.1.1. Theo dõi sự tăng trưởng trái
Để thiết lập đƣờng cong tăng trƣởng trái, trọng lƣợng tƣơi của 10 trái đƣợc hái ngẫu nhiên theo thời gian và cân ngay sau đó. Trọng lƣợng tƣơi của một số thành phần trái cũng đƣợc xác định theo thời gian: hột và vỏ hột, vỏ hột, nhân trái, phôi và vùng phôi từ phôi tâm.
2.1.2. Theo dõi sự rụng trái theo thời gian ở các giai đoạn tăng trưởng của phát hoa
Để theo dõi sự rụng trái bắt đầu xuất hiện từ giai đoạn nào trong quá tình tăng trƣởng của phát hoa, trục phát hoa đƣợc chia thành 4 giai đoạn:
13
- Giai đoạn 1: phát hoa dài độ 1cm (giai đoạn cựa gà);
- Giai đoạn 2: phát hoa sau giai đoạn 1 khoảng 4 ngày, dài độ 10 đến 15 cm. Lúc này trục phát hoa đã phân nhánh thứ cấp nhƣng hoa chƣa nở;
- Giai đoạn 3: phát hoa sau giai đoạn 2 khoảng 3 ngày, dài 25 - 30 cm. Lúc này trên các nhánh thứ cấp, gần gốc trục phát hoa, có 5-7 hoa đã nở;
- Giai đoạn 4: phát hoa sau giai đoạn 3 khoảng 3 ngày, kích thƣớc tối đa. Lúc này, có 10-15 hoa (hoặc hơn) trên các nhánh thứ cấp bắt đầu nở.
Trên mỗi giai đoạn, hoa đƣợc đánh dấu ở phía dƣới vùng rụng (phần gần thân). 15 hoa lƣỡng tính đƣợc theo dõi từ 10 trục phát hoa. Hoa vừa nở đƣợc tính là ngày 0. số trái rụng đƣợc đếm mỗi ngày. Phần trăm trái rụng đƣợc tính theo thời gian.
2.1.3. Theo dõi hiện tượng rụng theo thời gian ở giai đoạn phát hoa đạt kích thước tối đa
10 hoa lƣỡng tính đƣợc chọn ngẫu nhiên trên mỗi nhánh hoa, 10 nhánh hoa đƣợc chọn ngẫu nhiên trên mỗi trục phát hoa ở giai đoạn 4, mỗi trục phát hoa đƣợc chọn ngẫu nhiên trên một cây xoài trƣởng thành (10 lần lặp lại, mỗi lần với 100 hoa lƣỡng tính), số trái rụng đƣợc đếm mỗi ngày, trong suốt 14 ngày đầu và mỗi tuần sau đó cho đến khi thu hoạch. % trái rụng đƣợc tính theo thời gian.
Một đợt trái đƣợc đánh dấu tiếp gồm 50 trái 14 ngày tuổi của 10 phát hoa, số trái rụng đƣợc đếm mỗi tuần cho đến khi thu hoạch. Phần trăm trái rụng đƣợc tính theo thời gian.
2.1.4. Theo dõi sự rụng theo tuổi trái
Các trái 0, 3, 7 và 10 ngày tuổi đƣợc đánh dấu. Theo dõi tốc độ rụng trái liên tiếp 3 ngày sau đó. Đánh giá phần trăm rụng tổng cộng.
Để theo dõi đợt rụng tiếp theo, các trái từ 2-8 tuần tuổi đƣợc đánh dấu. Theo dõi tốc độ rụng trái trong tuần kế tiếp. Đánh giá phần trăm rụng tổng cộng.
2.2. Sinh trắc nghiệm khúc cắt vùng rụng trái xoài để theo dõi tốc độ rụng và xác định thời rụng t50 và xác định thời rụng t50
Cắt 10 khúc cắt vùng rụng trái non xoài (dài 4 mm chứa vùng rụng ở giữa). Khử trùng bằng HgCl2 0,l % trong 5 phút. Đặt các khúc cắt trong Erlen 60ml chứa 10 ml môi trƣờng MS [56] lỏng đã đƣợc hấp tiệt trùng, (phụ lục 2.1) [52]. Lắc liên tục với tốc độ 80 vòng / phút, ở 28 ± 10 C, ánh sáng 2000 ± 200 lux, độ ẩm 85 ± 5% (hình 2.1). Theo dõi sự rụng xảy ra tại vùng rụng sau 18, 24, 42, 48, 66, 72, 90, 96 giờ. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Xác định thời rụng t50, tức thời gian cần thiết để có 50% khúc cắt tách rời tại vùng rụng [49].
Hình 2.1:Sơ đồ sinh trắc nghiệm khúc cắt vùng rụng trái non xoài Cát Hòa Lộc (Mangifera indica L.).
2.3. Quan sát hình thái giải phẫu
2.3.1. Các biến đổi hình thái của phôi và vùng rụng
Phôi trong trái ở các ngày tuổi khác nhau đƣợc giữ trong FAA (Phụ lục 2.2) và đƣợc cắt dọc qua vùng rụng theo thời gian. Quan sát sự biến đổi phôi và vùng rụng sau việc cắt mỏng bằng máy cắt vi phẫu và nhuộm.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 30 lần đối với mỗi tuổi trái và đƣợc thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Thực vật, Đại học Maine, Cộng hòa Pháp.
2.3.2. Các biến đổi hình thái tại vùng rụng theo thời gian
2.3.2.1. Cấu trúc vùng rụng
Các khúc cắt vùng rụng trong trái xoài 7 ngày tuổi, sau khi khử trùng và nuôi cấy trong môi trƣờng MS (mục 2.2) sẽ đƣợc cắt ngang và quan sát dƣới kính
15
hiển vi qua sự nhuộm bằng dung dịch đỏ carmin và xanh iod [34]. 2.3.2.2. Các biến đổi về cấu trúc trong quá trình rụng
Các khúc cắt vùng rụng trong trái xoài 7 ngày tuổi (mục 2.2) sẽ đƣợc cắt dọc bằng máy cắt vi phẫu. Quan sát sự tan rã vách tế bào tại vùng rụng theo thời gian sau khi nhuộm.
2.3.3. Các biến đổi về cấu trúc vùng rụng dưới tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Lát cắt ngang lớp tế bào tại vùng rụng của các khúc cắt vùng rụng xoài, sau khi khử trùng, đƣợc đặt trong môi trƣờng MS dạng bán lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật: MA 2 mg/l, ABA 1mg/l, BA 1 mg/l. Quan sát sự tan rã vách tế bào theo thời gian tại vùng rụng dƣới kính hiển vi qua việc nhuộm bằng dung dịch đỏ carmin và xanh iod [34].
2.4. Khảo sát một số biến đổi sinh lí hóa học xảy ra tại vùng rụng của trái xoài ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau của phát hoa xoài ở các giai đoạn tăng trưởng khác nhau của phát hoa
Từ một số các kết quả trƣớc đó, khúc cắt vùng rụng của các trái non xoài 7 ngày tuổi đƣợc dùng để tìm hiểu các chỉ tiêu sinh hóa.
2.4.1. Cường độ hô hấp
Các khúc cắt vùng rụng nuôi trong môi trƣờng lỏng (mục 2.2) đƣợc đo cƣờng độ hô hấp bằng máy Hansatech của Anh. Sử dụng lo khúc cắt cho mỗi lần đo ở các thời điểm 0 giờ, trƣớc thời rụng 24 giờ, t50 và sau thời rụng 24 giờ . Kết quả là trung bình cộng của 3 lần lặp lại trên mỗi đối tƣợng.
2.4.2. Sự thoát khí etilen tại vùng rụng
Chuyển 0,5g khúc cắt vùng rụng trái non xoài sau khi nuôi cấy (mục 2.2) ở các thời điểm 0 giờ, trƣớc thời rụng 24 giờ, t50 và sau thời rụng 24 giờ vào trong các lọ nhỏ (thể tích 9 ml) có lót giấy thấm ẩm. Lọ đƣợc đậy nút kín và đặt chìm trong dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa để tránh sự khuếch tán khí etilen [37]. Sau 2
giờ, kể từ khi khúc cắt đƣợc đặt trong lọ kín, một mẫu khí 1 l đƣợc tách ra khỏi lọ. Hàm lƣợng etilen đƣợc đo bằng máy sắc kí khí tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích thí nghiệm thành phố Hồ Chí Minh.
2.4.3. Hàm lượng RNA và protein tổng số