Trong phƣơng pháp sắc kí pha động là các lƣu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc kí thành 2 nhóm lớn:
- Sắc kí khí - Sắc kí lỏng
Dựa vào cách tiến hành sắc kí ngƣời ta chia ra thành các phƣơng pháp sắc kí chủ yếu sau :
Hà Thị Tuyết 31 K34B-Hóa học
Đây là phƣơng pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp thụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng và pha đảo YMC, ODS, Dianion… Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại nhƣng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngƣợc lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trƣờng hợp nếu lực trọng trƣờng không đủ lớn gây ra hiện tƣợng tắc cột (dung môi không chảy đƣợc), khi đó ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đƣờng kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi của dung môi gọi là Rf với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng tùy thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5- 1/10), còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.
Trong sắc kí cột việc đƣa chất lên cột rất quan trọng, tùy thuộc vào lƣợng chất và dạng chất mà ngƣời ta có thể đƣa chất lên cột bằng các phƣơng pháp khác nhau. Nếu lƣợng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến nhất là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đƣa lên cột. Nếu tách tinh thì đƣa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lƣợng tối thiểu.
Hà Thị Tuyết 32 K34B-Hóa học
Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột :
Cách 1: Nhồi cột khô, theo cách này chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
Cách 2: Nhồi cột ƣớt, tức là chất hấp phụ đƣợc hòa tan trong dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu. Sau đó đƣa dần vào cột đến khi đủ lƣợng cần thiết. Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tƣợng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không đƣợc nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hƣởng tới hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hƣởng tới tiến độ cộng việc.
1.4.3.2. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (TLC) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra và định hƣớng cho sắc kí cột. TLC đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài ra TLC còn dùng để điều chế thu trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản TLC điều chế (bản đƣợc tráng silicagel dày hơn), có thể đƣa lƣợng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc kí, ngƣời ta có thể cạo riêng phần silicagel có chứa chất cần tách rồi giải hấp bằng dung môi thích hợp để thu đƣợc từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trƣng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.