3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3. Phương pháp PCR xác ựịnh chủng F4 Ẹcoli
Phương pháp chuẩn bị DNA sợi mẹ
- Ly tâm canh khuẩn ựã nuôi cấy ở 200 ộl BHI sau 16-18h/370C, lắc 220 vòng/ phút, bỏ dịch lấy cặn,
- Hòa tan cặn bằng 250 ộl nước cất, và ựun cách thủy 5 phút/1000C, lập tức chuyển vào ựá lạnh, giữ 3 phút,
- Ly tâm 4000v/phút trong 4 phút ở 40C, giữ trên ựá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR.
Chuẩn bị mồi (Primer)
Dung dịch mẹ (10 x) primer 100 ộM ựược chuẩn bị trong dung dịch TE pH 8,0, bảo quản ở -30OC. Pha loãng 1/10 primer 10x trong TE ựể có dung dịch làm việc (10 ộM), dùng 1 ộl primer mỗi loại cho 25 ộl phản ứng PCR.
để xác ựịnh sự có mặt của gene mã hóa pili F4, các ựộc tố ựường ruột LT, Sta và STb bằng phương pháp PCR, trình tự nucleotide của các cặp mồi ựặc hiệu ựược trình bày ở bảng 03.01.
Bảng 03.01. Trình tự oligo primer và sản phẩm dự kiến
Gene Trình tự nucleotide Sản phẩm (bp)
F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT
499
LT ATT TAC GGC GTT ACT ACT CTC TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT
272
STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG
158
STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG
133
Chuẩn bị phản ứng PCR
Trên ựá lạnh, chuẩn bị mỗi phản ứng PCR 25 ộl bằng cách tuần tự thêm các chất với nồng ựộ và thể tắch xác ựịnh như ở bảng 03.02 vào ống PCR 0,2 ml thành mỏng.
Bảng 03.02. Thành phần phản ứng PCR
TT Thành phần phản ứng Nồng ựộ Thể tắch (ộl)
1 Dnase-, Rnase- Free water Cat. #P119C, Promega 8,5
2 Sợi mẹ DNA Theo từng mẫu 2
3 Mồi xuôi (các loại) 10 ộM 1
4 Mồi ngược (các loại) 10 ộM 1
5 Gotaq Green MasterMix 2x (Cat. # M5122, Promega) 12,5
Tổng 25
Nhân gen: chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt như bảng 03.03.
Bảng 03.03. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Giai ựoạn Bước Tên Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ
A 1 Biến tắnh 94 5 1 1 Biến tắnh 94 1 2 Gắn mồi 52 1 B 3 Tổng hợp chuỗi 72 1 30 C 1 Tổng hợp chuỗi 72 10 1 D 1 Dừng 4 đến khi nhỏ gel 1
điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose
- Chuẩn bị gel Agarose 2%: Thêm 0,8 gam Agarose (Cat. #A9539 Sigma- Aldrich) vào 40 ml dung dịch 1 x TAE (Cat. #24710-030, Gibco), ựun sôi trong Microwave, 2 phút, ựể nguội tới 600C; ựổ gel vào khuôn nằm ngang ựã có gel- lược; ựể yên 20 phút cho tới khi gel ựông cứng; tháo bỏ lược.
- đặt gel Agarose vào máy ựiện di, bổ sung dung dịch ựiện di TAE 1x ựến khi ngập gel.
- Nhỏ mẫu vào các giếng tương ứng của gel; nhỏ thang DNA 1 giếng (Cat. #15628-019, Invitrogen). Chạy ựiện di ở 100 Vol trong 30 phút.
- Nhuộm gel trong Ethidium Bromide (Cat. #E-1385, Sigma-Aldrich) 5ộg/ml trong 10 phút. Kiểm tra sản phẩm PCR trên ựèn UV, chụp ảnh.