3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Môi trường, hóa chất
- Hoá chất dùng trong phản ứng Ab-ELISA:
Dung dịch phủ ựĩa (Coating buffer: Carbonate-Bicarbonate buffer PH=9,6), Cat. #C-304 do hãng Sigma-Aldrich cung cấp,
Sữa tách bơ (Skim Milk), Cat. #92720 do Marvel cung cấp
PBS (Photphate Buffer Saline) Cat. #P4417 do Sigma-Aldrich cung cấp, Tween 20, Cat. #40350-2 do Cica-Reagent cung cấp
Cơ chất màu OPD (Ortho-phenylenediamine), Cat. S2045 do công ty DAKO sản xuất.
H2SO4 Cat. #S:1/2-26-30-45 và H2O2 30%, Cat. #S:3-28-36/39-45 do Lachema cung cấp
- Hoá chất ựể làm phản ứng PCR:
DNase free-water Cat. #P119C, dung dịch TE 5 mM (TrisBase-EDTA pH 7,0), EDTA Disodium Cat. # H5031, và Tris Base Cat. # H5131 do Promega) cung cấp.
- Các loại hoá chất chạy ựiện di:
Agarose Cat. #A9539 và Ethidium Bromide Cat. #E-1385 do hãng Sigma- Aldrich cung cấp,
TAE Buffer (dung dịch mẹ 50x) Cat. #24710-030 do Gibco cung cấp
- Hoá chất chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn:
Pepton Cat. #M885 và thạch máu nền (Blood Agar base) Cat. #M089 do hãng Himedia cung cấp,
Yeast extract Cat. #L21 do OXOID sản xuất
BHI (Brain Heart Infusion) Cat. #1.10493.0500 và Agar Cat. #3644679 do Merck cung cấp
- Môi trường 3 ống nghiệm
KIA Cat. #1.03913.0500 và Mannitol-Mobility Cat. #1.05404.0500 do hãng Merck cung cấp; Urea-Indole Cat. #880239 do Bio-Rad cung cấp.
- Hóa chất bảo quản huyết thanh: Natriazit (NaN3) Cat. #5224343 do Merck cung cấp.
- Bổ trợ dầu Freund Complete Adjuvant Cat. #F5881 do Sigma-Aldrich cung cấp.
- Hóa chất thông thường phòng thắ nghiệm. 3.3.3. Máy móc, trang thiết bị
- Máy móc
Máy PCR (Thermocycler), máy ựiện di (Biorad), hộp ựèn tử ngoại (Việt nam), máy lắc ựĩa chuyên dụng (Stat fax 2200, Awareness), máy ựọc ELISA (Elx800, Biotek), máy sấy trứng Centrifuge spray dryer- LPG-5, Vortex (Genie).
- Trang thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thắ nghiệm
Buồng cấy vô trùng (Biosafety Cabinet), cân phân tắch, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, bể ấm, tủ lạnh thường (40C), các tủ lạnh -300C, -800C.
Micro-pipette các loại 2 ộl, 10 ộl, 20 ộl, 100 ộl, 200 ộl, 1000 ộl và ựầu tip tương ứng.
Dụng cụ thông thường phòng thắ nghiệm: Ống nghiệm, ựĩa Petri, ựèn cồn, que cấy, pince, kéo, ựĩa ELISA, bơm tiêm, bông cồn, ống ly tâm 14 ml; 50 ml; Eppendorf loại 0,2 ml và 1,5 ml, máng nhựa, giá và khay ựựng.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ
- Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ mô tả, dịch tễ học thống kê, dịch tễ học phân tắch. Cụ thể: Lập biểu mẫu ựiều tra; điều tra theo phương pháp ựiều tra thống kê ngẫu nhiên 3 huyện, mỗi huyện 3 xã, mỗi xã 3 thôn có các hộ chăn nuôi lợn nái sinh sản và lợn từ sau cai sữa; Trực tiếp ựiều tra qua chẩn ựoán lâm sàng kết hợp với mổ khám những lợn mắc tiêu chảy sắp chết hoặc chết do tiêu chảỵ
- Phương pháp ựiều tra lợn từ sau cai sữa mắc tiêu chảy theo ựàn và cá thể. Số ựàn có lợn mắc tiêu chảy chết và số con chết trong từng ựàn.
- Phương pháp ựiều tra lợn từ sau cai sữa mắc tiêu chảy theo quy mô ựàn nuôi từ 10 con trở xuống, từ 11 ựến 20 con, trên 21 con.
- điều tra lợn từ sau cai sữa bị tiêu chảy theo tình trạng vệ sinh chuồng trại, môi trường tốt, trung bình, kém; theo loại lợn ựịa phương, lai, ngoại; theo các mùa xuân, hè, thu, ựông và theo tháng tuổi sau cai sữạ
3.4.2. Phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹcoli Phương pháp thu thập mẫu phân
Dùng tăm bông ngoáy vào hậu môn của lợn tiêu chảy, mẫu phân ựược lấy trực tiếp từ trực tràng của lợn con; cho tăm bông vào ống Eppendorf có sẵn dung dịch bảo quản. Mẫu ựược ký hiệu, ghi rõ tắnh biệt, ngày tuổi và ngày lấy mẫu, ựược bảo quản trong hộp lạnh và chuyển về phòng thắ nghiệm trong ngàỵ
Phương pháp chuẩn bị các môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Các môi trường nuôi cấy thông thường và môi trường giám ựịnh ựặc tắnh sinh vật hóa học của Ẹcoli bao gồm nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch KIA, Mannitol-Mobility, Urea-IndoleẦựược chuẩn bị như thường quỵ
Phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹcoli
Mẫu phân mới ựược nuôi cấy, phân lập giám ựịnh ựặc tắnh sinh vật hóa học và giám ựịnh PCR như thường quy và ựược tóm tắt ở sơ ựồ hình 03.01.
Hình 03.01. Sơ ựồ phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹcoli