bởi enzyme
Guérard và cộng sự (2001) đã nghiên cứu thủy phân bao tử cá ngừ bằng enzyme Alcalase tại nhiệt độ 50oC, pH = 8. Sau đó dịch thu được sau 5,5 giờ thủy phân được đem làm đông khô. Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm này dùng làm chất bổ sung nitơ cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật có kết quả tốt như những pepton công nghiệp dùng nuôi cấy vi sinh vật. (Guérard và cộng sự, 2001).
Thiansilakul và cộng sự (2007) nghiên cứu về thành phần, tính chất và khả năng chống oxi hóa của dịch đạm thủy phân từ cá nục sồ (Decapterus maruadsi) băm nhỏ đã khử chất béo bằng enzyme Flavourzyme. Với hiệu suất thủy phân đạt 60%, thủy phân được dịch đạm thủy phân có hàm lượng protein 48% và hàm lượng tro 24,56%. Dịch đạm có màu nâu vàng, chứa hàm lượng cao các loại acid amin thiết yếu (48,04%) và có arginine và lysine là các acid amin chiếm ưu thế. Chất khoáng Na+ cũng là thành phần chủ yếu của dịch đạm. Dịch đạm thủy phân protein có khả năng hòa tan tốt lên đến 99%. Chỉ số hoạt động nhũ hóa của dịch thủy phân giảm khi tăng độ cô đặc trong khi khả năng tạo bọt của dịch tăng tỷ lệ thuận với độ cô đặc dịch. Theo dõi thời gian bảo quản ở 25oC và 4oC trong 6 tuần cho thấy khả năng chống oxi hóa và độ hòa tan của dịch đạm thủy phân giảm nhẹ, trong khi màu vàng của dịch lại tăng lên. Ở nhiệt độ 25oC màu vàng tăng nhiều hơn nhiệt độ 4oC (Thiansilakul và cộng sự, 2007).
Ở Thái Lan, Nilsang và cộng sự (2004) nghiên cứu thủy phân protein cá từ dung dịch cá cô đặc, một sản phẩm của công nghiệp đồ hộp cá sử dụng enzyme Flavourzyme và Kojizyme. Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm nhiệt độ, thời gian và nồng độ enzyme trên độ thủy phân. Điều kiện tối ưu cho enzyme Flavourzyme là nồng độ enzyme so với cơ chất là 50LAPU/g protein, cơ chất cô đặc 20% (w/w), nhiệt độ 45oC, thời gian thủy phân là 6 giờ. Trong khi giá trị với enzyme Kojizyme là 40 LAPU/g protein, cơ chất 20% (w/w), nhiệt độ 50oC, thời gian là 6 giờ. Enzyme Kojizyme cho sản phẩm chứa acid amin có vị đắng một chút như tryptophan trong suốt quá trình thủy phân trong khi dùng với Flavourzyme thì không có hiện tượng này. Dịch thủy phân mang sấy phun thu được sản phẩm có chứa hàm lượng protein cao lên đến 66%. (Nilsang, 2004).
Aristotelis và cộng sự (2011) dùng enzyme papain để thủy phân phế liệu cá trong điều kiện kiểm soát tại một nhà máy với quy mô thí điểm hàng loạt thu dịch đạm thủy phân protein cá. Tính toán cân bằng khối lượng, ước tính tốc độ thủy phân, tỷ lệ protein hòa tan và sản lượng thu hồi. Sử dụng toàn bộ các phần của phế liệu cá bao gồm cả đầu và vây để thủy phân với tỷ lệ enzyme bổ sung là 0,5% (5g/kg), pH tự nhiên, kết quả protein cá thủy phân hoàn toàn trong 1 giờ tại nhiệt độ 40oC. Khả năng thủy phân tương tự nhau khi tỷ lệ nước bổ sung là 1/1 và 2/1 phế liệu cá/nước. Dịch đạm thủy phân thu được có tỷ lệ protein hòa tan trong khoảng 71-86%. Dịch đạm thủy phân này được sấy phun ở nhiệt độ khí vào khoảng 200-300oC, áp suất 5-7 bar thu được bột đạm thủy phân có hàm lượng protein cao 890 g/kg (Aristotelis và cộng sự, 2011).
Cũng ở Thái Lan, Kanpairo và cộng sự (2012) nghiên cứu sử dụng phế thải từ quá trình chế biến đồ hộp cá ngừ (dịch cá ngừ chế biến sẵn) cho sản xuất bột hương cá ngừ. Dịch cá ngừ chế biến sẵn được ly tâm và cô đặc đến 15% tổng chất rắn lơ lửng (TSS). Maltodextrin (DE9) được thêm vào để là tăng TSS cho độ cô đặc lên tới 20, 22, 24và 26, sau đó sấy phun ở 180oC. Thành phần và tính chất của bột hương cá ngừ được xác định như sau: bột có màu nâu tái. Thành phần bột chứa 7,46± 0,3% ẩm, 28,49±0,5 đến 42,06±0,1% protein và 3,44±0,3 đến 4,25±0,3 tro. Hương của bột có mùi thơm cao, bột hương cá ngừ tốt nhất khi độ cô đặc là 22% TSS (Kanpairo, 2012).
Amiza và cộng sự (2013) nghiên cứu đặc tính hóa lý của bột đạm thủy phân cá basa bạc bằng enzyme Alkalase ở 3 chế độ thủy phân như sau: DH 43% (Alkalase 1%, nhiệt độ thủy phân 50oC, thời gian 90 phút), DH 55% (Alkalase 1,5%, nhiệt độ thủy
phân 40oC, thời gian 120 phút) và DH 68 (Alkalase 2%, nhiệt độ thủy phân 60oC, thời gian 180 phút). Trong quá trình thủy phân, kiểm soát pH bằng NaOH 1N. Kết thúc quá trình thủy phân bất hoạt enzyme bằng đun nóng hỗn hợp thủy phân ở nhiệt độ 85oC trong 20 phút. Sau đó ly tâm dịch thủy phân thu được trong 20 phút để tách phần protein không hòa tan và chất béo. Kết quả chỉ ra rằng dịch đạm thủy phân chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu, trong đó giàu lysine và glutamate. Chế độ thủy phân DH 68 chứa các peptide hòa tan tốt hơn. Dịch đạm thủy phân được sấy phun ở nhiệt độ đầu vào/đầu ra là 185oC/108oC, bổ sung 5% maltodextrin. Sản phẩm bột đạm thủy phân thu được có hàm lượng protein đạt từ 32,9% (DH 43%) đến 35,6% (DH 68) (Amiza và cộng sự, 2013).
Vũ Ngọc Bội (2004) công bố các nghiên cứu về protease B.subtilis S5 cho thấy có thể dùng nước cất để thu nhận protease với hoạt tính cao từ canh trường nuôi
B.subtilisS5 theo phương pháp nuôi cấy bán rắn và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật bằng cách dùng ethanol để gây kết tủa. Protease thu được có nhiệt độ thích hợp là 55oC và pH thích hợp là 6,0. Protease có thể sử dụng rất tốt trong thủy phân cơ thịt cá tạp để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày (Vũ Ngọc Bội, 2004).
Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng cá và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ thích hợp từ 50-55oC và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng (Đỗ Văn Ninh, 2004)
Phạm Thị Hải Âu, Nguyễn Thúy Hường (2010) đã nghiên cứu lựa chọn ba loại enzyme thương phẩm có khả năng thủy phân protein là Flavouzyme; Acalase và Protamex để thủy phân protein từ cá tạp và phế liệu cá và lựa chọn được enzyme Acalase thích hợp nhất cho quá trình thủy phân cá tạp và phế liệu cá. Các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân protein cá tạp và phế liệu cá bằng enzyme Acalase là: đối với cá tạp: Ion Ca2+ 0,01%; Nhiệt độ thủy phân 55oC; thời gian thủy phân 22 giờ; tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,6%, tỷ lệ nước bổ sung/nguyên liệu là 1/1; pH nước bổ sung là 6. Hiệu suất thủy phân 90,58%. Đối với phế liệu cá: Ion Ca2+ 0,01%. Nhiệt độ thủy phân 52oC, thời gian thủy phân 20 giờ; Tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,3%; Tỷ lệ nước bổ sung/nguyên liệu 1/1; pH nước bổ sung là 7,2. Hiệu suất thủy phân 46,48%. Dịch thủy
phân sau khi cô về 20oBx được sấy trong thiết bị sấy phun, nhiệt độ đầu vào/nhiệt độ đầu ra là 115oC/100oC, tốc độ bơm tiếp liệu 30 ml/phút.Khoảng 8-10 kg cá tạp sẽ thu được 1 kg bột đạm thủy phân có chất lượng tốt, với hàm lượng protein 82,87%, hàm lượng đạm acid amin chiếm 33-45% đạm tổng số (tùy theo chất lượng cá tạp)(Phạm Thị Hải Âu, Nguyễn Thúy Hường, 2010)
Từ các nghiên cứu trên thế giới và trong nước cho thấy việc sử dụng nguyên liệu thủy sản chế biến các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phục vụ đời sống đang rất được quan tâm nghiên cứu. Sản phẩm thủy phân protein từ cá có thể dưới dạng dịch đạm thủy phân, cô đặc hoặc sấy khô thành bột đạm thủy phân để sử dụng cho các quá trình chế biến khác. Dịch đạm thủy phân cá là sản phẩm được tạo thành do sự phân cắt protein của cá bởi enzyme tạo thành các peptide nhỏ hơn, thường chứa 2-20 amino acids. Trong những năm gần đây dịch đạm thủy phân cá có sức hấp dẫn lớn với ngành công nghệ sinh học thực phẩm vì nguồn nguyên liệu thì dồi dào, hàm lượng protein cao với sự cân bằng các amino acid và chứa đựng các peptide sinh học có khả năng chống oxy hóa, hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn (Chalamaiah và cộng sự, 2012). Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân protein cá nục là một hướng đi mới mang đến nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và đời sống.
Hình 2.1. Chồi dứa
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Cá nục sử dụng trong nghiên cứu này là cá nục thuôn (Decapterus macrosoma),
còn tươi, không bị dập nát, chưa qua cấp đông có kích thước trung bình từ 170-200 mm, kích cỡ 15-19 con/kg được thu mua một lần ở cảng cá Máy Chai, Hải Phòng.
2.1.2. Enzyme
• Enzyme bromelin thô
Chồi dứa được thu mua ở chợ Tam Bạc, Hải Phòng, đảm bảo lá còn xanh, không dập nát và úa vàng. Chồi dứa vận chuyển về phòng thí nghiệm được xử lý loại bỏ phần lá xanh, chỉ lấy phần lõi của chồi dứa có màu trắng xanh. Tất cả chồi dứa tươi được bảo quản ở nhiệt độ -20oC.
Chồi dứa được nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme bromelin thô dưới 2 dạng: enzyme bromelin dạng bột và dạng dịch.
• Enzyme flavourzyme
Enzyme Flavourzyme do hãng Novozyme – Đan Mạch cung cấp. Enzyme Flavourzymechứa cả hai hoạt tính endopeptidease và exopeptidease, có các đặc tínhkỹ thuật như sau: pH thích hợp từ 5 – 7, nhiệt độ thích hợp 45 – 60oC, hoạt tính 500LAPU/g (Leucine Aminopeptidease Units)/g và cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 0-10oC.
2.1.3. Hóa chất
Natri hydroxit 0,1N; Acid sunfuric 0,1N, formaldehyde, acid chlohydric 37% của Việt Nam, acid sunfuric 98%, NaOH 96%, NaH2PO4, Na2HPO4của Trung Quốc
2.1.4. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này:
Bể ổn nhiệtWB14 Memmert- Đức. Tủ ấm Memmert - Đức. Máy xay ép đùn- Trung Quốc. Máy đo pH cầm tay- Singapore. Máy chưng cất đạm Kjeldahl - Đức.
Khúc xạ kế. Tủ sấy Shelab FX5-2 - Mỹ. Cân điện tử Sartorius BP 221S -Thụy Sĩ. Máy sấy phun ly tâm tốc độ cao ZPG5lít/h- mã sản xuất 201004069 của Changzhou Yutong drying equipment Co, LTD, Trung Quốc.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định sự thay đổi hoạt độ enzyme bromelin thô theo thời gian bảo quản
Cách thu enzyme bromelin ở dạng bột: chồi dứa thái mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 45oC trong tủ sấy có quạt gió. Thời gian sấy từ 8-10 giờ. Lúc chồi dứa khô sẽ đạt độ ẩm khoảng 10%, chồi dứa khô đem xay nghiền bằng máy xay khô tạo dạng bột. Bột dứa khô chính là bromelin dạng bột.
Cách thu enzyme bromelin ở dạng dịch: chồi dứa, cắt miếng, xay nát bằng máy xay nghiền, sau đó lọc dịch qua một lớp vải lọc, bỏ bã. Phần dịch đã được lọc đem ly tâm thu lấy dịch trong, đó là enzyme bromelin dạng dịch.
Sự thay đổi hoạt độ của 2 dạng chế phẩm enzyme bromelin thô (dạng bột và dạng dịch) trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ 4oC được xác định bằng phương pháp Anson cải tiếnvà theo dõi cứ 7 ngày lấy mẫu một lần và kiểm tra lại hoạt độ enzyme. Từ kết quả xác định sự thay đổi hoạt độ của 2 dạng chế phẩm enzyme bromelin thô sẽ lựa chọn dạng enzyme phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Xác định thành phần khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của cá nục thuôn
• Xác định thành phần khối lượng của nguyên liệu Cá nục thuôn
Xay nhỏ
Xác định thành phần hóa học cơ bản nước, protein, lipid và khoáng
Hình 2.2. Xác định thành phần khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của cá nục thuôn
Rửa Xác định thành phần khối lượng: thịt, đầu, xương, vây, nội tạng
Cá nục thuôn rửa sạch, cân khối lượng từng con sau đó tách từng phần: thịt, đầu, xương, vây, nội tạng. Thành phần khối lượng của từng phần được tính theo công thức:
xi (%)= (mi/M)x100
Trong đó: mi: khối lượng của từng phần M: khối lượng tổng ban đầu
• Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu
Cá nục thuôn rửa sạch, xay nhỏ, trộn đều mẫu, cân mẫu và tiến hành phân tích theo các phương pháp hướng dẫn trong TCVN.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát Bất hoạt enzyme Bất hoạt enzyme Cá nục thuôn Cấp đông Xay nhỏ Rã đông Thủy phân Lọc
Dich đạm thủy phân
Cô đặc
Sấy phun
Bột đạm thủy phân Rửa
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát
Xác định ảnh hưởng của: - Tỷ lệ hỗn hợp
enzyme/cơ chất
- Kích thước nguyên liệu - Nhiệt độ thủy phân - Lượng nước bổ sung - pH
- Thời gian thủy phân
Đánh giá chất lượng của dịch đạm thủy phân:
- Hiệu suất thu hồi N - Tỷ lệ Naa/Nts
Thuyết minh sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Nguyên liệu
Cá nục thuôn sau khi mua được mang về phòng thí nghiệm, rửa sạch, để riêng 5kg cá nguyên con, bao gói trong túi PE để sử dụng cho các thí nghiệm thay đổi kích thước nguyên liệu. Phần còn lại xay nhỏ bằng máy xay có đường kính mắt sàng 9 mm, bao gói trong các túi PE, mỗi túi 500g, hàn kín. Tất cả được cấp đôngở nhiệt độ -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm.
Trước mỗi thí nghiệm nguyên liệu được rã đông bằng cách để ở nhiệt độ phòng hoặc để trong ngăn mát tủ lạnh từ ngày hôm trước.
Thủy phân
Cân mỗi mẫu thí nghiệm 100g nguyên liệu cho vào bình tam giác 250 ml, thêm muối và nước rồi khuấy đều. Cho mẫu vào bể ổn nhiệt hoặc tủ ấm đã được nâng nhiệt đến nhiệt độ thí nghiệm. Khi nhiệt độ của khối mẫu đạt yêu cầu, cho enzyme bromelin thô và enzymeflavourzyme vào, trộn đều hỗn hợp, đậy nắp miệng bình và thực hiện quá trình thủy phân. Mẫu được lấy theo thời gian thí nghiệm.
Bất hoạt enzyme
Kết thúc quá trình thủy phân hỗn hợp được bất hoạt enzyme bằng cách đun sôi trong thời gian 15 phút.
Lọc
Sau khi thủy phân và bất hoạt enzyme, hỗn hợp được đưa đi lọc qua 2 lớp vải lọc tách riêng phần bã và dịch. Phần dịch sau đó lọc qua giấy lọc thu dịch đạm thủy phân.
Cân xác định khối lượng phần bã và đong xác định thể tích dịch lọc. Lấy mẫu dịch lọc mang đi xác định các chỉ tiêu Nts, Nf và NNH3. Xác định tỷ lệ Naa/Ntsvà hiệu suất thu hồi (HSTH) của dịch lọc.
Cô đặc
Phần dịch lọcthu được đưa đi cô đặc loại nước bằng cách cô đặc cách thủy ở nhiệt độ cao tạo thuận lợi cho quá trình sấy phun đạt chất lượng và hiệu quả.
Sấy phun
Dịch đạm thủy phân cô đặc được phối trộn với chất trợ sấy và cho vào máy sấy phun với các chế độ sấy được chọn. Bột đạm thủy phân đạt được các chỉ tiêu sau: tỷ lệ Naa/Nts> 60%, độ ẩm 8-10%.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện biên của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân trình thủy phân
2.2.4.1. Thí nghiệm xác địnhtỷ lệ hỗn hợp enzyme bromelin thô/flavourzyme
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ hỗn hợp enzyme bromelin thô/flavourzyme như hình 2.4.
Bất hoạt enzyme
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ kết hợp enzyme bromelin và flavourzyme
Cá nục xay nhỏ
Rã đông
Thủy phân
- Nhiệt độ 50oC, pH tự nhiên - Lượng nước bổ sung: 20% - Thời gian: 24 giờ
- Nồng độ muối: 2% - Tỷ lệ hỗn hợp enzyme/cơ chất là 2%, bromelin/flavourzyme lần lượt từ 5/1; 10/1; 15/1; 20/1; 25/1; 30/1 Lọc Lựa chọn tỷ lệ kết hợp bromelin/flavourzyme thích hợp Cấp đông Phân tích NNH3, Nts, Nf và xác định tỉ lệ Naa/Nts Dịch đạm thủy phân
Nhiều nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho enzyme bromelin thô hoạt động là 50-60oC (Ketnawa, 2012; Phạm Thị Trân Châu, 1987). Tương tự enzyme bromelin, khoảng nhiệt độ thích hợp cho enzyme flavourzyme hoạt động là45 - 60oC Theo nghiên cứu của Vũ Ngọc Bội (2004) cho thấy lượng muối thích hợp nhất cho quá trình thủy phân cá mối bằng chế phẩm enzyme protease B. Subtilis S5 là 3%, theo nghiên cứu sơ bộ của đề tài cho thấy hàm lượng muối2-3% thích hợp cho quá trình