V. Nhi ệm vụ nghiên cứu
2.4.2. Phương pháp hóa sinh
2.4.2.1. Định lượng L-lysine bằng phương pháp đo mật độ quang
Thuốc thử ninhydrin - ferric phản ứng cao và đặc biệt với L-lysine ở pH=1,0. Ion sắt sẽ hạn chế sự phản ứng của ninhydrin với proline, nithine, glycine, arginine và histidine. Chinard (1952), tìm thấy ninhydrin phản ứng cao và có khả năng chọn được L-lysine, proline, nithine ở pH=1,0. Sự thêm ion sắt hạn chế phản ứng của ninhydrin với proline, ở pH=1,0 tăng độ nhạy cảm của ninhydrin với L-lysine. Phương pháp này có thể sử dụng để định lượng mẫu L-lysine không cần pha loãng. Dimethyl sulfoxide bổ sung vào để hòa tan phức hợp ninhydrin - ferric - L-lysine, làm tăng phản ứng của thuốc thử ninhydrin - ferric với L- lysine [38].
Chuẩn bị mẫu phân tích: Sau mỗi thời điểm lên men ta lấy dịch lên men và đem ly tâm 13000 vòng/phút trong khoảng thời gian 10 phút để loại bỏ sinh khối và lấy dịch lỏng để phân tích L-lysine.
Tiến hành
Hút 20 mẫu trộn hoàn toàn với 0,66mL của dung dịch A và 0,37mL dung dịch B. Hỗn hợp đã trộn được đun ở nhiệt độ 1000
C khoảng 20 phút, sau đó làm lạnh dưới vòi nước. Tiếp theo bổ sung 4mL DMSO (Dimethyl sulfoxide), 6mL nước cất và vortex mẫu. Mẫu đối chứng cách làm tương tự nhưng thay mẫu bằng nước cất 2 lần. Đem mẫu đo ở bước sóng 470nm [38].
Từ kết quả đo kết hợp với đường chuẩn (phụ lục 1) suy ra lượng L-lysine có trong dịch lên men ở từng thời điểm khảo sát.
2.4.2.2. Phương pháp xác định đường khử bằng 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS)
Nguyên tắc: thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3 - amino -5-nitrosalicylic có màu đỏ cam. Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic
(DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử hiện diện trong mẫu [8, 31, 33].
Chuẩn bị mẫu phân tích: sau mỗi thời điểm lên men ta lấy dịch đó và đem ly tâm (13000vòng/phút) với thời gian khoảng 10 phút để loại bỏ sinh khối và lấy dịch lỏng để phân tích đường sót còn lại trong dịch lên men.
Tiến hành
Lấy 3mL dung dịch mẫu đã pha loãng sau ly tâm cho vào ống nghiệm và bổ sung thêm 1mL DNS (dinitrosalicylic), vortex và bịt kín mẫu đem đun 1000
C với thời gian 5 phút. Sau đó làm lạnh tối ở nhiệt độ phòng. Mẫu đối chứng cách làm cũng tương tự nhưng thay mẫu bằng nước cất hai lần. Đo độ hấp phụ màu ở bước sóng 560nm.
Từ kết quả đo kết hợp với đường chuẩn (phụ lục 2) suy ra nồng độ đường có trong dịch lên men ở từng thời điểm khảo sát [8].