đựng trong nước cất. Cho vào thân bình Warburg 2 ml nước cất, dùng kẹp cho mẫu vật vào thân bình. Cho vào trụ giữa 0,5 ml dung dich KOH 20%.
Dùng kẹp cho mảnh giấy lọc đã xếp vào trụ giữa. Thực hiện một bình nhiệt khí áp kế với 2,5 ml nước cất (không có mẫu vật), thoa vaselin vào mặt trong cổ bình (kể cả ống nhánh). Gắn bình Warburg vào áp kế, xoay nhẹ nút và bình để chỗ ráp thật kín. Cột thun quanh các móc để giữ bình không rớt .
Gắn áp kế vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước, mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển.
Cho máy lắc 10 phút (thời gian này cho nhiệt độ không khí trong bình ổn định với nhiệt độ nước là 250C. Sau 10 phút, tắt máy lắc, điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch mười. Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế kín, mở máy lắc, ghi thời điểm t1 đồng thời tắt đèn: thí nghiệm đo bắt đầu.
Khi đọc số đo (sau 15 phút): ngưng máy lắc, điều chỉnh chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 10, đọc mực chất lỏng bên nhánh mở của áp kế. Tính trị số ∆p bằng số mm chất lỏng chênh lệch giữa 2 áp kế. Tính trị số ∆v ở bình (thể tích oxy bị mô hấp thụ) qua hệ thức ∆v=k. ∆p, từ đó tính ra cường độ hô hấp của mỗi thí nghiệm (µl oxygen hấp thu/ g TLT / giờ).
2.2.9. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của cây mầm lúa cây mầm lúa
Mục đích thí nghiệm: Xác định được hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong cây mầm lúa in vitroở các thời điểm khác nhau để từ đó có phương pháp tác động đến cây trong điều kiện stress.
Phương pháp thí nghiệm: Cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol 3% được dùng để đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 5 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy.
* Li trích và phân đoạn
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992).
Nghiền 1 (g) mẫu trong 50 ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80%, lắc 20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chung 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dưới quạt còn khoảng 1 ml.
Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml, dịch nước được chỉnh pH = 2,5 với dung dịch HCl 1%. Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15 ml eter, lắc bình lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp.
Tách riêng dịch nước (lớp dưới) vào và dịch eter (lớp trên). Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa. Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: AIA, AAB và GA3) và dịch nước.
Dịch nước được chỉnh pH = 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ). Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho từng phần) thêm 3 ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lại như vậy một lần nữa với 3 ml NaHCO3 8%. Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5 ml.
* Sắc ký lớp mỏng:
Dịch trích của các mẫu được chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30 ± 10C. Dung môi di chuyển là chloroform: metanol : acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích). Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm.
* Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm:
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ mẫu ở các thời điểm khác nhau được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf
của mỗi chất chuẩn. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng, cạo lấy các hạt silicagel trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abscisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Bùi Trang Việt, 1992). Hạt lúa được cho nẩy mầm trong tối, sau 72 giờ diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 10C. Hoạt tính của auxin và acid abscisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch trích và các dung dịch AIA 1 mg/l và AAB 1 mg/l.
Sinh trắc nghiệm cytokinin
Hoạt tính cytokinin được đo bằng dịch trích trắc nghiệm tử diệp dưa leo. Hột dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp. Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/l sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%.
Sinh trắc nghiệm gibberellin
Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%. Các hột với rễ mầm nhú ra 1 mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 cây mầm. Hoạt tính gibberellin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với đối chứng sau 72 giờ xử lý và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 10 mg/l.
Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt. Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.
Hình 2.1.Sơ đồ ly trích và xác định hoạt tính tương đương của hormone thực vật (theo Bùi Trang Việt, 1992; Nguyễn Du Sanh và cs, 2011)