Trong nuôi cấy in vitro, sự sinh trưởng của cây chủ yếu được xác định bởi các thành phần của môi trường dinh dưỡng. Đường trong môi trường nuôi cấy đã được coi là nguồn carbon duy nhất cho sự phát triển của tế bào, chồi, cành, và thậm chí cả cây con. Đường có vai trò trong các con đường trao đổi chất và chuyển đổi năng lượng cho sự tăng trưởng của tế bào. Trong nuôi cấy mô thực vật, đường như một nguồn cung cấp carbohydrate để cung cấp một điều kiện nuôi tối ưu cho các tế bào (Gauchan, 2012).
Nồng độ đường được lựa chọn phụ thuộc vào loại và tuổi của mô cấy. Phôi non yêu cầu một lượng đường tương đối cao. Đường phổ biến nhất được sử dụng là saccharose ở nồng độ 2 - 5%. Saccharose được coi như một nguồn carbon chủ yếu trong nuôi cấy in vitro vì chúng hiển diện phổ biến nhất trong nhựa vỏ cây của nhiều carbohydrate thực vật (Gauchan, 2012).
Mannitol là một đường 6 cacbon mạch hở, một trong những polyols phổ biến nhất trong tự nhiên. Một trong những chức năng sinh lý quan trọng của mannitol là kiểm soát tế bào ở thế nước thấp, hoạt động như trong điều kiện ưu trương (Iwamoto và Shiraiwa, 2005). Mannitol cũng có thể hoạt động giống một enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và peroxidase (POX), có hiệu quả tái sinh và bảo tồn nguồn gen (Tenuifolius và Dianthus, 2009). Mannitol được sử dụng trong phòng thí nghiệm như một phương tiện để gây khô hạn trong nuôi cấy mô thực vật (Jain et al, 1996).
Chương 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
* Hạt Lúa Nàng Thơm Chợ Đào (Oryza sativaL.) được cung cấp từ Viện Khoa Học Kĩ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.
Ảnh 2.1. Hạt lúa Nàng Thơm Chợ Đào * Vật liệu sinh trắc nghiệm
- Khúc cắt diệp tiêu cây mạ lúa (Oryza sativaL.)72 giờ tuổi - Trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativaL.) 72 giờ tuổi - Tử diệp cây mầm dưa leo (Cucumis sativa L.) 48 giờ tuổi
2.2. Phương pháp
2.2.1. Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa để từ đó tiến hành cảm ứng stress nước trên cây mầm lúa.
Phương pháp thí nghiệm: Cân 5 (g) hạt lúa và ngâm nước, cứ sau 1 giờ thì cân lại khối lượng đến khi nào trọng lượng tươi của hạt lúa không đổi, đó chính là điểm bão hòa nước.
2.2.2. Quan sát giải phẫu hình thái
Các hạt lúa in vitro trong các môi trường nuôi cấy ở điều kiện bình thường hay xử lí stress được chụp hình mẫu cắt dọc, cắt ngang bằng tay hay máy cắt microtome, sau đó được nhuộm bằng đỏ carmine – xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
• Mẩu được cắt bằng tay
Phương pháp giải phẫu lần lượt qua các bước:
- Mẫu được cắt ngang hay cắt dọc thành từng lát nhỏ 0,5 – 1 mm.
- Tẩy mẫu bằng javel trong 30 phút, sau đó rửa sach mẫu nhiều lần bằng nước cất, chậm giấy thấm cho hết nước.
- Ngâm mẫu trong acid acetic 20% trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất. - Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iot trong 15 phút, rửa sạch bằng nước cất.
- Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học.
• Mẫu được cắt bằng máy cắt microtome có kích thước 7 µm 1. Cố định mẫu
Mẫu được cố định ngay trong môi trường FAA (formadehid acol acid) sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700
2. Đúc mẫu
Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút.
-
Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút
-
Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút
Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong : - Butanol 1: 30 phút.
- Butanol 2: 30 phút.
- Butanol 3: 30 phút.
- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm.
- Paraffin 1: 1 giờ. - Paraffin 2: 1 giờ. - Paraffin 3: 1 giờ.
Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3. Cắt và dán mẫu
Mẫu được cắt dọc thành từng lát mỏng 7µm nhờ máy vi phẫu (microtome). Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300
C trong hai ngày để cho mẫu thật khô.
4. Nhuộm mẫu
Loại paraffin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: - Methylcyclohexan 1: 10 phút.
- Methylcyclohexan 2: 10 phút. Rửa mẫu bằng etanol 1000
. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: - Etanol 1000: 5 phút.
- Etanol 950: 5 phút.
-
Etanol 700: 5 phút.
- Nước cất: 5 phút.
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học (Lê Thị Trung, 2003).
2.2.3. Khảo sát sự tăng trưởng cây mầm lúa in vitro
Mục đích thí nghiệm: Tìm môi trường thích hợp với sự phát triển của cây mầm lúa in vitro.
Phương pháp thí nghiệm: 4 môi trường được sử dụng:
MS, MS1/2 (hàm lượng khoáng đa lượng giảm 1/2), MS1/5 (khoáng đa lượng giảm 1/5) và MS1/10 (khoáng đa lượng giảm 1/10). Mỗi nghiệm thức gồm 5 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm gồm 3 hạt với 3 lần lặp lại.
1 nghiệm thức = 3*5*3 = 45 mẫu.
30 phút, sau đó đưa vào phòng nuôi cấy và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 – 7 lần.
Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 2 0
C, ánh sáng 2000 ± 200 lux.
Hạt được xem là nảy mầm khi có rễ lú ra khoảng 1 mm. Các chỉ tiêu sinh trưởng được theo dõi sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày từ khi cấy mẫu.
- Chiều dài rễ được xác định từ phần gốc rễ cho tới đỉnh rễ.
- Chiều dài chồi được xác định từ phần ngang gốc lên hết đỉnh chồi.
Môi trường số cây mầm tăng trưởng tốt sẽ được chọn để thực hiện các nghiệm thức tiếp theo.
Tuổi cây mầm được tính từ ngày bắt đấu cấy hạt (ngày 0).
2.2.4. Khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong môi trường MS1/2 với các nồng độ đường khác nhau các nồng độ đường khác nhau
Trong sự tăng trưởng của cây mầm đường saccharose có vai trò cung cấp năng lượng trong khi đường mannitol không cung cấp nguồn năng lượng mà sẽ gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy.
2.2.4.1. Với nồng độ saccharose khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ đường saccharose phù hợp với sự phát triển của cây mầm lúa in vitro.
Phương pháp thí nghiệm: Từ kết quả ở mục 2.2.3, hạt lúa được cấy trên môi trường MS1/2 có sự thay đổi nồng độ saccharose lần lượt là 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3,0% (MS1/2, đối chứng).
Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy.
2.2.4.2. Với nồng độ mannitol khác nhau
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ mannitol thích hợp để cảm ứng stress trong sự phát triển của cây mầm lúa in vitro.
Phương pháp thí nghiệm: Thay đường saccharose bằng đường mannitol với các nồng độ lần lượt là 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% trên môi trường MS1/2 (đối chứng).
Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy.
2.2.4.3. Với nồng độ đường saccharose và mannitol khác nhau
Mục đích thí nghiệm: Xác định sự tác động đồng thời của hai loại đường lên sự phát triển của cây mầm lúa in vitro.
Phương pháp thí nghiệm: Mẫu được cấy trên môi trường MS1/2 có bổ sung cả hai loại đường để kiểm tra ảnh hưởng của đường đến sự tăng trưởng của cây mầm lúa. Nồng độ đường trong môi trường MS1/2 là 3%, các nghiệm thức được bố trí sao cho tổng lượng đường trong môi trường là 3%:
Các loại đường Nghiệm thức
Saccharose (%) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Mannitol (%) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy.
2.2.5. Theo dõi sự tăng trưởng rễ nhánh cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ sung saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp bổ sung saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp
Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng tạo và phát triển của rễ nhánh trên môi trường bình thường (MS1/2) và môi trường không có đường cũng như trên môi trường bị stress.
Phương pháp thí nghiệm: 3 môi trường được chọn - MS1/2 (saccharose 3%, đối chứng)
- MS1/2 loại saccharose + mannitol 3% - MS1/2 + mannitol 3%
Theo dõi sự phát triển rễ nhánh (số lượng, chiều dài) sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy.
Rễ nhánh được tính là những rễ không sinh ra từ vị trí của rễ mầm.
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian bị stress nước trong sự phát triển của cây mầm lúa để khi đưa ra môi trường tự nhiên. Sau khi bị stress cây lúa có khả năng sinh trưởng bình thường, chống chịu tốt hơn.
Phương pháp thí nghiệm:
Các nghiệm thức được bố trí như sau: MS1/2 (đối chứng)
Mannitol 3% (24 giờ) → MS1/2 : 24 + ĐC Mannitol 3% (48 giờ) → MS1/2 : 48 + ĐC Mannitol 3% (72 giờ) → MS1/2 : 72 + ĐC
MS1/2 (24 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 24 + Man 3% MS1/2 (48 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 48 + Man 3% MS1/2 (72 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 72 + Man 3%
Chỉ tiêu theo dõi: chiều dài rễ và chiều dài chồi sau 3 ngày từ khi nuôi cấy.
2.2.7. Xác định trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa trên các môi trường cảm ứng mannitol 3% kết hợp thời gian bị stress khác nhau môi trường cảm ứng mannitol 3% kết hợp thời gian bị stress khác nhau
Mục đích thí nghiệm: Từ các nghiệm thức của mục 2.2.6, trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa được theo dõi để thấy được sự tăng trưởng của cây mầm.
Phương pháp thí nghiệm: Cân khối lượng 30 hạt cho từng nghiệm thức. Sau 3 ngày nuôi cấy, mẫu được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch, thấm khô và cân để xác định trọng lượng tươi. Trọng lượng khô được xác định bằng cách sấy khô ở 800C sau 24 giờ, cân lại. Tiếp tục sấy ở 600C và cân đến khi trọng lượng không đổi.
2.2.8. Xác định cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol 3% ở các thời gian bị stress khác nhau MS1/2 bổ sung mannitol 3% ở các thời gian bị stress khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mục đích thí nghiệm: Xem sự thay đổi cường độ hô hấp của cây mầm lúa khi bị stress nước với các thời gian khác nhau so với cây không xử lý.
Phương pháp thí nghiệm: Đo cường độ hô hấp của cây mầm lúa ở trên hai môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol 3% theo thời gian: 5 giờ (kết quả 2.2.1 đối chứng), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ bằng máy Warburg ở 250 C ± 20C, trong tối.
Cân chính xác trọng lượng tươi cây mầm lúa, rửa sạch mẫu nhẹ nhàng và đựng trong nước cất. Cho vào thân bình Warburg 2 ml nước cất, dùng kẹp cho mẫu vật vào thân bình. Cho vào trụ giữa 0,5 ml dung dich KOH 20%.
Dùng kẹp cho mảnh giấy lọc đã xếp vào trụ giữa. Thực hiện một bình nhiệt khí áp kế với 2,5 ml nước cất (không có mẫu vật), thoa vaselin vào mặt trong cổ bình (kể cả ống nhánh). Gắn bình Warburg vào áp kế, xoay nhẹ nút và bình để chỗ ráp thật kín. Cột thun quanh các móc để giữ bình không rớt .
Gắn áp kế vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước, mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển.
Cho máy lắc 10 phút (thời gian này cho nhiệt độ không khí trong bình ổn định với nhiệt độ nước là 250C. Sau 10 phút, tắt máy lắc, điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch mười. Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế kín, mở máy lắc, ghi thời điểm t1 đồng thời tắt đèn: thí nghiệm đo bắt đầu.
Khi đọc số đo (sau 15 phút): ngưng máy lắc, điều chỉnh chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 10, đọc mực chất lỏng bên nhánh mở của áp kế. Tính trị số ∆p bằng số mm chất lỏng chênh lệch giữa 2 áp kế. Tính trị số ∆v ở bình (thể tích oxy bị mô hấp thụ) qua hệ thức ∆v=k. ∆p, từ đó tính ra cường độ hô hấp của mỗi thí nghiệm (µl oxygen hấp thu/ g TLT / giờ).
2.2.9. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của cây mầm lúa cây mầm lúa
Mục đích thí nghiệm: Xác định được hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong cây mầm lúa in vitroở các thời điểm khác nhau để từ đó có phương pháp tác động đến cây trong điều kiện stress.
Phương pháp thí nghiệm: Cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol 3% được dùng để đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 5 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy.
* Li trích và phân đoạn
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992).
Nghiền 1 (g) mẫu trong 50 ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80%, lắc 20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa chung 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dưới quạt còn khoảng 1 ml.
Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml, dịch nước được chỉnh pH = 2,5 với dung dịch HCl 1%. Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15 ml eter, lắc bình lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp.
Tách riêng dịch nước (lớp dưới) vào và dịch eter (lớp trên). Từ dịch nước thu được, lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa. Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: AIA, AAB và GA3) và dịch nước.
Dịch nước được chỉnh pH = 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ). Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho từng phần) thêm 3 ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lại như vậy một lần nữa với 3 ml NaHCO3 8%. Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5 ml.
* Sắc ký lớp mỏng:
Dịch trích của các mẫu được chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30 ± 10C. Dung môi di chuyển là chloroform: metanol : acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích). Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm.
* Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm:
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ mẫu ở các thời điểm khác nhau được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf
của mỗi chất chuẩn. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng, cạo lấy các hạt silicagel trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh trắc nghiệm xác định hoạt tính.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abscisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Bùi Trang Việt, 1992). Hạt lúa được cho nẩy mầm trong tối, sau 72 giờ diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 10C. Hoạt tính của auxin và acid abscisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch