Mục đích: Tuyển chọn ra được 2 dòng vi khuẩn phân giải lân vô cơ hữu hiệu nhất từ các dòng đã phân lập được.
Phương pháp
Đánh giá hoạt tính phân giải lân vô cơ khó tan của các dòng vi khuẩn dựa nồng độ P2O5 có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ P2O5càng cao thì lượng lân khó tan được hòa tan càng nhiều. Người ta thường dùng thuốc thử Ascorbic- Amoniummoplydate- Potassium antymonyl tatrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩnphân giải bằngphương pháp xanh molipdate (Watanable and Olsen, 1965) để xác định nồng độ P2O5
Lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với amoniummolybdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolybdate có màu vàng.
H2PO4- + NH4+ + MoO42++ 2H+ (NH4)3[P(MoO10)4] (màu vàng).
Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo+6 bị khử thành Mo+3 hay Mo+2 cho dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân hòa tan có trong huyền phù vi khuẩn điều kiện khử của môi trường. Trong môi trường acid vừa phải nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ với hàm lượng P theo quy luật của Bir Lambeg.
Các bước thực hiện.
Chuẩn bị vi khuẩn gốc
▪ Chuẩn bị vi khuẩn gốc: Lấy một phần vi khuẩn đã được phân lập ròng cho vào ống nghiệm chứa NBRIP lỏng chứa Ca3(PO4)2, ủ lắc trong 3 ngày với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
▪ Chủng 1ml vi khuẩn gốc vào bình tam giác 50ml chứa 20ml môi trường NBRIP lỏng ( Nautiyal, 1999), để trên máy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút, 3 lần lặp lại (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007).
▪ Vào ngày nuôi thứ 5, 10 và 15 tiến hành lấy mẫu. Lấy 2ml phần dịch trong xác định hàm lượng lân hòa tan bằng phương pháp Blue - molypden.
Xác định hàm lượng lân hòa tan (Cao Ngọc Điệp, 2012).
▪ Dựng đường chuẩn P2O5: Có 6 ống nghiệm (20ml) được đánh dấu từ 0 tới 5 theo hàm lượng P2O5 có trong ống, tiếp tục thêm vào mỗi ống nghiệm các hóa chất theo bảng sau:
Bảng 4 – Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5
Các thành phần trong ống nghiệm sau đó được trộn đều trên máy vortex và để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra. Theo lý thuyết là nồng độ P2O5 càng cao thì màu dung dịch tạo thành càng đậm tức là các ống nghiệm sẽ đậm dần từ 0 đến 5.
▪ Chuẩn bị mẫu để đo OD
Hút 2 ml mẫu ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và sử dụng phần dịch trong để tiến hành xác định hàm lượng lân trong mẫu bằng phương pháp Blue – molypden.
Cho vào ống nghiệm các hóa chất như sau: + 5ml nước khử khoáng.
+ 0,5ml dung dịch mẫu. + Thêm 4ml dung dịch B. + 3ml nước khử khoáng.
Dung dịch được trộn đều trong vortex, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. ▪ Đo lân.
Đo hàm lượng lân dựa trên phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880nm (OD=880nm).
Đo OD ở 6 ống nghiệm đường chuẩn trước,sau đó đo OD của mẫu.
Giá trị OD của ống số 0 (không có P2O5, không có màu xanh) được coi là mẫu blank và đưa giá trị về 0 rồi tiến hành đo các ống còn lại.
Dùng các phần mềm thống kê chuyên dụng để vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P2O5.
Ống nghiệm Thành phần
0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 5 5 5 5 5 5
Dung dịch lân chuẩn 10ppm (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4
Phương trình đường chuẩn có dạng: y = a*x + b + Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/l)
y là độ hấp thu quang (OD880nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng P2O5.
Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa dòng tuyển chọn để nhận diện sơ bộ Thử nghiệm catalase
Mục đích: phát hiện vi khuẩn có hệ enzyme catalase, catalase hiện diện ở vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý.
▪ Sử dụng dung dịch hydrogen peroxide 30%, dung dịch đệm phosphate pH 7.0 ▪ Lấy một ít sinh khối của vi khuẩn từ khuẩn lạc phân lập được đặt lên lamen đã
được lau sạch. Sau đó nhỏ 1 giọt H2O2 lên lamen. Quan sát sự sỏi bọt (Nếu có). ▪ Kết quả: thử nghiệm (+) khi có hiện tượng sủi bọt do có sự tạo thành khí O2 và
(-) khi không có sự sủi bọt. Thử nghiệm oxidase
Mục đích: kiểm tra khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của vi khuẩn, hệ enzyme này có ở vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý.
▪ Cho giấy lọc vào đĩa petri hay lamen được lau sạch. Nhỏ một giọt thuốc thử một ít sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc vào nơi có thuốc thử trên giấy lọc. Quan sát sự tạo màu.
▪ Kết quả: Oxidase (+) nếu có sự xuất hiện màu xanh đậm ngay lập tức hay khoảng sau 10s. Ngược lại oxidase (-) khi không xuất hiện màu.
Nhuộm bào tử
Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp thụ. Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững. Thuốc nhuộm thường sử dụng là aminlin (chủ yếu là loại kiềm hay trung tính). Thành phần tế bào vi sinh vật khác nhau nên sự bắt màu cũng khác nhau.
Cách thực hiện :
▪ Trước khi nhuộm bào tử phải tiến hành sốc nhiệt (700C trong 10 phút) hoặc để trong tủ lạnh 20C trong 2 ngày nhằm kích thích vi khuẩn tạo bào tử. Tiến hành làm tiêu bản và nhuộm bào tử
▪ Nhuộm xanh-metylen theo loffer: Nhỏ 1 giọt xanh-metylen lên vết bôi, hơ nóng đến sôi nhẹ và giữ như vậy từ 15 – 20 giây.
▪ Rửa lại với nước cất, sau đó tiếp tục nhuộm với fucshin giữ khoảng 30 giây. Rửa lại với nước cất, hơ khô. Quan sát dưới kính hiển vi bằng giọt dầu.
▪ Kết quả : Bào tử bắt màu xanh, tế bào bắt màu hồng.