Để khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ của các dòng vi khuẩn phân lập được trước tiên ta lấy vi khuẩn từ ống trữ ria, cấy trên môi trường NBRIP đặc chứa lân vô cơ khó tan.
Những dòng vi khuẩn có khả năng tồn tại được trên môi trường đặc thù để kiểm tra được xem là có khả năng phân giải lân vô cơ và sẽ được kiểm tra chỉ số PSI (chỉ số hòa tan lân) dựa trên đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn và đường kính vòng halo (vòng sáng hình thành trên môi trường kiểm tra).
Cách thực hiện:
▪ Dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường NBRIP lỏng, ủ ở 300C trên máy lắc với tốc độ là 120 vòng/phút trong 3 ngày.
▪ Pha loãng vi khuẩn bằng cách hút 100 µL vi khuẩn gốc cho vào ống nghiệm có chứa 900 µL nước cất vô trùng.
▪ Chia đĩa ra thành 4 phần bằng nhau, dùng pipet hút 5 µL vi khuẩn đã được pha loãng nhỏ vào mỗi phần của đĩa, để khô dưới ngọn lửa đèn cồn, sau đó ủ ở 300C. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
▪ Sau 2-5 ngày, những vi khuẩn có khả năng phân giải lân sẽ phát triển trên môi trường và có tạo thành những vùng sáng, là những vòng tròn đồng tâm trong suốt quanh khuẩn lạc.
▪ Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng halo ở ngày thứ 2 và thứ 7 sau khi dòng. Từ đó tính được chỉ số hòa tan lân (PSI) của mỗi dòng dựa trên công thức:
PSI =𝑑(𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐)+𝑑(𝑣ò𝑛𝑔 𝑠á𝑛𝑔)
𝑑(𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐)
Trong đó: d (khuẩn lạc) là đường kính tạo bởi khuẩn lạc D (vòng sáng) là đường kính tạo bởi vòng sáng halo
▪ Sau khi tính toán được PSI, chọn ra ít nhất 2 dòng vi khuẩn có chỉ số PSI cao để quan sát hình dạng, khả năng chuyển động, thực hiện các thí nghiệm sinh hóa tiếp theo.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Vi khuẩn được quan sát chuyển động bằng giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400lần.
Các bước quan sát vi khuẩn
▪ Lau sạch kính mang vật bằng cồn và làm khô.
▪ Nhỏ một giọt nước cất tuyệt trùng lên kính mang vật.
▪ Khử trùng kim cấy hay kim mũi giáo bằng ngọn lửa đèn cồn và làm nguội. ▪ Dùng đầu kim cấy vào khuẩn lạc,lấy một ít vi sinh vật hòa lẫn vào giọt nước trên
kính mang vật.
▪ Dùng kính đậy vật (lamelle) đậy lên giọt nước sao cho hạn chế sự tạo bọt khí trong mẫu.
▪ Tiến hành quan sát để kiểm tra độ ròng của mẫu, chú ý quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn.
Chú ý: Mẫu dược cho là ròng khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ thấy được một loại vi khuẩn, có sự tương đồng về hình dạng, kích thước và không lẫn tạp một loại vi sinh vật nào khác.
Nhuộm Gram
Sau khi xác định được các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn (kính mang vật được lau sạch bằng cồn và làm khô)
▪ Nhỏ một giọt nước đã khử trùng lên kính mang vật. ▪ Khử trùng kim cấy trong ngọn lửa đèn cồn.
▪ Dùng kim cấy lấy một ít vi sinh vật cho vào giọt nước,trải đều và mỏng theo hình xoắn ốc.
▪ Hơ mặt dưới của kính mang vật dưới ngọn lửa đèn cồn để giết chết vi sinh vật và cố định chúng trên kính mang vật.
▪ Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định vi sinh vật,để trong 60s. ▪ Rửa nước từ 2-3 lần; chậm nhẹ cho khô nước.
▪ Nhỏ dung dịch iod để yên trong 60s.
▪ Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính đến khi giọt cồn và aceton không còn màu tím nữa.
▪ Nhỏ một đến hai giọt fushin hay safranin để yên trong 60s. ▪ Rửa nước vài giây
▪ Dùng giấy chậm nhẹ cho khô nước hoặc hơ dưới lửa đèn cồn. ▪ Quan sát trên kính hiển vi
Chú ý màu của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet thì đó là vi khuẩn Gram dương, còn vi khuẩn có màu hồng của fucshin là vi khuẩn Gram âm (Gs.Ts Cao Ngọc Điệp - PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương, 2012).