Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Grammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Moraxellaceae Giống: Acinetobacter Hình 4 – Vi khuẩn Acinetobacter (http://www.proprofs.com/quiz-school/upload/yuiupload/1470144707.jpg)
Vi khuẩn Acinetobacter có dạng hình cầu, chiều rộng vi khuẩn khoảng 0,9-1,6 µm và dài 1,5-2,5 µm (Towner, 2006). Là vi khuẩn gram âm và không hình thành bào tử. Nhiệt độ vào khoảng 33-350C và pH khoảng 5,5-6,0 là điều kiện thuận lợi cho loài vi khuẩn này phát triển (Juni, 2005). Khuẩn lạc tạo thành từ loài vi khuẩn này thường
không có màu và một số ít có màu trắng, màu kem và bề mặt khuẩn lạc nhày hoặc trơn láng. Đường kính khuẩn lạc vào khoảng 1 đến 2 mm (Towner, 2006).
Acinetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, bùn, hệ thống bùn của hệ thống xử lý nước thài và trong phân của một số loại vật nuôi như gia súc và gia cầm. Có thể phát triển trên môi trường với các thành phần chất khoáng, năng lượng và nguồn carbon đơn giản như acetate, pyruvate, hay lactate (Baumann, 1968).
Một số dòng trong Acinetobacter được ứng dụng để xừ lý các chất thải gây ô nhiễm môi trường như: biphenyl, chlorinated biphenyl, phenol, benzoate, dầu thô, loại bơ phosphate hữu cơ khó tan và kim loại nặng (Abdel-El-Haleem,.2003). Acinetobacter
hấp thu lân trong chất thải bằng cách tổng hợp thành dạng polyphosphate tích lũy bên trong tế bào (Beacham et al., 1992).
Một số loài vi khuẩn thuộc Acinetobacter có khả năng phân hủy lân hữu cơ khó tan như: Acinetobacter aerobacter, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwofii,…. 2.3.3 Vi khuần Pseudomonas Phân loại Ngành: Proteobacteria Lớp: Grammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas Hình 5 – Vi khuẩn Pseudomonas (http://germsandworms.files.wordpress.com/2013/03/pseudonomasaeruginosa.jpg?w=300&h=225)
Pseudomonas có khả năng phân hủy các loại chất thải chứa lân vô cơ và hữu cơ khó tan ở phạm vi rộng và trong những điều kiện khác nhau. Loài vi khuẩn này tồn tại khắp nơi trong môi trường đất, nước và trong cả phân của các loài gia súc, gia cầm. Nhiều loài của chúng phát triển rất nhanh và có khả năng sử dụng các loại cơ chất kể cả các loại cơ chất mang tính độc hại như hydrocarbon vòng thơm và các chất béo (Moore et al., 2006).
Vi khuẩn Pseudomonas có hình que hơi cong hoặc thẳng không có xoắn ốc. Vi khuẩn Gram âm, hiếu khí không bắt buộc, di chuyển bằng tiêm mau ở một đầu. Chiều dài 1,5- 5,0 μm và đường kính 0,5 – 1,0 μm. Vi khuẩn Pseudomonas không tăng trưởng trong điều kiện pH < 4.5 , nhiệt độ sinh trưởng 28- 300C và pH =7 (Moore et al., 2006). Một số loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas bao gồm: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, pseudomonas agarici, Pseudomonas amidgdali, Pseudomonas gracilis…
2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam.
2.4.1 Trên thế giới
Hàm lượng lân trong các loại đất thường rất thấp vì vậy bón phân là biện pháp hữu hiệu để tăng hàm lượng lân dễ tan trong đất. Nhưng 2/3 lượng phân bón vào đất bị chuyển hóa trở thành lân khó tan khiến cây trồng không hấp thụ được hoặc bị rửa trôi đi. Do đó hiệu quả của việc bón phân lân bị giảm đi nhiều. Việc nghiên cứu ra các vi sinh vật phân giải lân khó tan đã giải quyết được vấn đề này. Chúng vừa giảm được lượng phân bón cho cây vừa có thể sử dụng được lượng lân khó tan trong đất. Từ những lợi ích như vậy, vi sinh vật phân giải lân được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Nhiều công trình nghiên cứu ở Ấn Độ, Châu Âu và Mỹ cho thấy hiệu quả to lớn của các vi sinh vật phân giải lân.
Các nghiên cứu của Sen và Paul, 1957, Katznelson và Bose, 1967; Ostwal và Bhide, 1999 cho thấy các chủng vi khuẩn đặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus, các chủng nấm thuộc loài Penicillium, Asperillus có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành dễ tan trong đất nhờ tiết ra các aid hữu cơ như acid fomic, acetic, lactic, propionic, fumaric, gluconic và acid succinic. Các acid này làm giảm pH môi trường và hòa tan các dạng lân khó tan.
Ở Liên Xô (cũ) sản phẩm phân bón vi sinh vật thương mại “phosphobacterin” với sự có mặt của B.megaterium và phosphaticum đã được sử dụng rộng rãi ở Liên Xô và các nước Đông Âu, làm tăng năng suất cây trồng từ 5-10% so với đối chứng. Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng tăng đáng kể so với mẫu đối chứng. Người ta tính nếu sử dụng vi sinh vật phân giải lân tương đương với bón 50 kg P2O5/ha.
Grimer and Mount (1981) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas putida phân lập từ đất xung quanh cây họ đậu. Ông thấy rằng khi bổ xung P.putida vào đất trồng làm cho cây tăng khả năng hấp thu lân của cây.
Datta et al. (1982) đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus có khả năng phân giải lân khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc Ấn Độ. Chủng này vừa có khả năng sinh IAA là hormon sinh trưởng rất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hoá lân khó tan.
Gopal et al. (2009) cũng đã phân lập được vi khuẩn Pseudomonas fluorescens
trong ruột của giun đất Eudrilus sp có khả năng phân giải lân khó tan cung cấp lượng khoáng cần thiết giúp tăng trưởng cây trồng ngoài ra còn ức chế được nấm bệnh.
Alvaro (2009) phân lập được 2 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân và kích thích sinh trưởng của cây trồng từ rễ cỏ ở Tây Ban Nha thuộc chi mới là Acinetobacter.
N. Uma Maheswari and S. Sudha (2013) đã phân lập được 4 loài vi khuẩn phân giải lân trong ruột của giun đất Eisenia Foetida là Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogens, P. Fluorescens.
2.4.2 Ở Việt Nam
Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Mai (1999) đã nghiên cứu khả năng tiết enzyme phosphatase của 10 chủng vi sinh vật phân giải lân và nhận thấy rằng ngoài khả năng phân giải lân khó tan các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinh enzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc tác không thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa lân.
Việt Nam, năm 2007 Quyền Đình Thi et al. phân lập Acinetobacter từ mẫu nước biển và nghiên cứu các yếu tố như nguồn carbon, nitrogen, nhiệt độ và mọi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp enzume protease trong vi khuẩn này.
Nguyễn Thị Dơn (2012) đã phân lập được 26 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan cả K và P từ mẫu vật liệu phong hóa núi Sập, tỉnh An Giang. Trong đó có 4 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lân cao nhất có mức độ đồng hình với Bacillus,
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
Sử dụng thiết bị và dụng cụ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ
3.1.1. Dụng cụ, thiết bị
‒ Đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, bình tam giác ‒ Tủ lạnh trữ mẫu
‒ Que cấy, đèn cồn, lam, lamen
‒ Tủ cấy vi sinh vật Biosafe II và tủ ủ vi sinh vật ‒ Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật).
‒ Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi – international (Đức) ‒ Bộ micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000 (Đức) ‒ Tủ sấy EHRET (Đức) và cân điện tử Startorius (Đức) ‒ Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
‒ Cân điện tử Sartorius (Đức) ‒ Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan) ‒ pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ) ‒ Máy vortex
…..Cùng với một số dụng cụ thiết bị khác trong phòng thí nghiệm.
3.1.2. Nguyên vật liệu
Mẫu phân trùn quế (được nuôi trên các nguồn cơ chất khác nhau như: phân bò, phân heo, phân vịt) thu tại các cơ sở nuôi Trùn quế tại Vĩnh Long, Cần Thơ và Sóc Trăng.
3.1.3. Hóa chất, môi trường
Hóa chất.
‒ Nhuộm Gram: Crystal violet, iod, ethanol + aceton, Safranin (hoặc fuchsin) và nước cất.
‒ Định lượng lân hòa tan: (NH4)6MoO24.4H2O ( Amoniummolybdate) KsbOC4H2O6 (Potassium antymonyl tartrate) , H2SO4 đậm đặc, acid ascorbic.
▪ Dung dịch A :
(1) 12g ( NH4)6MoO24.4H2O ( Amoniummolybdate) + 250ml H2O (2) 0,2908g KsbOC4H2O6 ( Potassium antymonyl tartrate) + 100ml H2O (3) Lấy 140ml H2SO4 đậm đặc và thêm H2O vào từ từ cho đủ 1 lít (4) Cho (1), (2) vào (3) sau đó thêm H2O vào cho đủ 2 lít.
▪ Dung dịch B: 1,05g acid ascorbic + 200ml dung dịch A
Môi trường
Môi trường phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan là môi trường NBRIP gồm các thành phần như sau:
Bảng 3 – Thành phần môi trường NBRIP
Hóa chất Hàm lượng Glucose 10g (NH4)2SO4 0.1g MgSO4.7H2O 0.25g MgCl2.6H2O 5g KCl 0.2g Ca3PO4 5 Agar 18
Bromothylmol Blue 0,5% trong KOH 0,2N (ml/l)
6
pH 7
Nước 1 lít
(* Nguồn Nautiyal,1999)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Bắt đầu từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014.
Địa điểm: Thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và Vi sinh vật thuộc Viện Nghiên Cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ.
3.2.1. Thu mẫu
Thu mẫu: Trùn quế được nuôi khoảng 2 tháng từ ba nguồn cơ chất khác nhau (phân bò, phân heo, phân vịt). Sau khi thu hoạch trùn ta thu được phân trùn.
Cách lấy mẫu: Ở các vật dụng nuôi trùn quế, sau khi thu hoạch trùn tiến hành bỏ đói, không cung cấp thêm thức ăn cho trùn từ 2-3 ngày. Sau đó iến hành thu chất thải từ cơ thể phân trùn, đó chính là phân trùn. Lấy khoảng 5g phân trùn từng loại (trên các nguồn cơ chất là phân vịt, phân heo, và phân bò) cho vào túi nilon sạch ở nhiệt độ phòng đến khi làm thí nghiệm.
3.2.2 Phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan.
Cân 1g phân trùn đem hòa tan trong 99ml dung dịch nước muối 0,9%, lắc trong 10 phút.
Sau đó pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-2 đến 10-5
Dùng pipet hút 0.1mL dung dịch pha loãng ở các nồng độ cấy trải trên đĩa petri có chứa môi trường phân lập NBRIP (Bảng 3). Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Ủ khoảng 2-3 ngày ở nhiệt độ 300C trong tủ ủ để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc.
Khi khuẩn lạc phát triển trên đĩa petri, chọn khuẩn lạc cấy vào đĩa petri khác chứa cùng loại môi trường phân lập, lập lại nhiều lần đến khi thu được vi khuẩn ròng.
Cấy chuyển vi sinh vật phân lập được vào ống thạch nghiêng có chứa môi trường phân lập để ở 300C trong 48h và được trữ lạnh ở 40C.
3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn có tiềm năng phân giải lân vô cơ khó tan
Để khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ của các dòng vi khuẩn phân lập được trước tiên ta lấy vi khuẩn từ ống trữ ria, cấy trên môi trường NBRIP đặc chứa lân vô cơ khó tan.
Những dòng vi khuẩn có khả năng tồn tại được trên môi trường đặc thù để kiểm tra được xem là có khả năng phân giải lân vô cơ và sẽ được kiểm tra chỉ số PSI (chỉ số hòa tan lân) dựa trên đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn và đường kính vòng halo (vòng sáng hình thành trên môi trường kiểm tra).
Cách thực hiện:
▪ Dùng que cấy lấy một phần sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 3ml môi trường NBRIP lỏng, ủ ở 300C trên máy lắc với tốc độ là 120 vòng/phút trong 3 ngày.
▪ Pha loãng vi khuẩn bằng cách hút 100 µL vi khuẩn gốc cho vào ống nghiệm có chứa 900 µL nước cất vô trùng.
▪ Chia đĩa ra thành 4 phần bằng nhau, dùng pipet hút 5 µL vi khuẩn đã được pha loãng nhỏ vào mỗi phần của đĩa, để khô dưới ngọn lửa đèn cồn, sau đó ủ ở 300C. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
▪ Sau 2-5 ngày, những vi khuẩn có khả năng phân giải lân sẽ phát triển trên môi trường và có tạo thành những vùng sáng, là những vòng tròn đồng tâm trong suốt quanh khuẩn lạc.
▪ Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng halo ở ngày thứ 2 và thứ 7 sau khi dòng. Từ đó tính được chỉ số hòa tan lân (PSI) của mỗi dòng dựa trên công thức:
PSI =𝑑(𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐)+𝑑(𝑣ò𝑛𝑔 𝑠á𝑛𝑔)
𝑑(𝑘ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑙ạ𝑐)
Trong đó: d (khuẩn lạc) là đường kính tạo bởi khuẩn lạc D (vòng sáng) là đường kính tạo bởi vòng sáng halo
▪ Sau khi tính toán được PSI, chọn ra ít nhất 2 dòng vi khuẩn có chỉ số PSI cao để quan sát hình dạng, khả năng chuyển động, thực hiện các thí nghiệm sinh hóa tiếp theo.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Vi khuẩn được quan sát chuyển động bằng giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400lần.
Các bước quan sát vi khuẩn
▪ Lau sạch kính mang vật bằng cồn và làm khô.
▪ Nhỏ một giọt nước cất tuyệt trùng lên kính mang vật.
▪ Khử trùng kim cấy hay kim mũi giáo bằng ngọn lửa đèn cồn và làm nguội. ▪ Dùng đầu kim cấy vào khuẩn lạc,lấy một ít vi sinh vật hòa lẫn vào giọt nước trên
kính mang vật.
▪ Dùng kính đậy vật (lamelle) đậy lên giọt nước sao cho hạn chế sự tạo bọt khí trong mẫu.
▪ Tiến hành quan sát để kiểm tra độ ròng của mẫu, chú ý quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn.
Chú ý: Mẫu dược cho là ròng khi quan sát dưới kính hiển vi chỉ thấy được một loại vi khuẩn, có sự tương đồng về hình dạng, kích thước và không lẫn tạp một loại vi sinh vật nào khác.
Nhuộm Gram
Sau khi xác định được các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn (kính mang vật được lau sạch bằng cồn và làm khô)
▪ Nhỏ một giọt nước đã khử trùng lên kính mang vật. ▪ Khử trùng kim cấy trong ngọn lửa đèn cồn.
▪ Dùng kim cấy lấy một ít vi sinh vật cho vào giọt nước,trải đều và mỏng theo hình xoắn ốc.
▪ Hơ mặt dưới của kính mang vật dưới ngọn lửa đèn cồn để giết chết vi sinh vật và cố định chúng trên kính mang vật.
▪ Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định vi sinh vật,để trong 60s. ▪ Rửa nước từ 2-3 lần; chậm nhẹ cho khô nước.
▪ Nhỏ dung dịch iod để yên trong 60s.
▪ Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính đến khi giọt cồn và aceton không còn màu tím nữa.
▪ Nhỏ một đến hai giọt fushin hay safranin để yên trong 60s. ▪ Rửa nước vài giây
▪ Dùng giấy chậm nhẹ cho khô nước hoặc hơ dưới lửa đèn cồn. ▪ Quan sát trên kính hiển vi
Chú ý màu của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet thì đó là vi khuẩn Gram dương, còn vi khuẩn có màu hồng của fucshin là vi khuẩn Gram âm (Gs.Ts Cao Ngọc Điệp - PGs.Ts Nguyễn Hữu Hiệp Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương, 2012).
3.2.4. Tuyển chọn và nhận diện sơ bộ các dòng vi khuẩn phân giải lân mạnh.
Mục đích: Tuyển chọn ra được 2 dòng vi khuẩn phân giải lân vô cơ hữu hiệu nhất từ các dòng đã phân lập được.
Phương pháp
Đánh giá hoạt tính phân giải lân vô cơ khó tan của các dòng vi khuẩn dựa nồng độ P2O5 có trong dịch nuôi cấy. Nồng độ P2O5càng cao thì lượng lân khó tan được hòa tan càng nhiều. Người ta thường dùng thuốc thử Ascorbic- Amoniummoplydate- Potassium antymonyl tatrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩnphân giải bằngphương pháp xanh molipdate (Watanable and Olsen, 1965) để xác định nồng độ P2O5
Lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với amoniummolybdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolybdate có màu vàng.
H2PO4- + NH4+ + MoO42++ 2H+ (NH4)3[P(MoO10)4] (màu vàng).
Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo+6 bị khử thành Mo+3 hay Mo+2 cho dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân hòa tan có trong huyền phù vi khuẩn điều kiện khử của môi trường. Trong môi trường acid vừa phải nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ với hàm lượng P theo quy luật của Bir Lambeg.
Các bước thực hiện.
Chuẩn bị vi khuẩn gốc
▪ Chuẩn bị vi khuẩn gốc: Lấy một phần vi khuẩn đã được phân lập ròng cho vào ống nghiệm chứa NBRIP lỏng chứa Ca3(PO4)2, ủ lắc trong 3 ngày với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
▪ Chủng 1ml vi khuẩn gốc vào bình tam giác 50ml chứa 20ml môi trường NBRIP lỏng ( Nautiyal, 1999), để trên máy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút, 3 lần lặp lại (Lăng