- Sự lignin hóa: Sự lignin hóa là một cơ chế quan trọng trong tắnh kháng, cơ chế này xảy ra sau khi bị nhiễm do những sinh vật như nấm,
IIỊ VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGHIÊN CỨU
3.1 đối tượng, thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
* đối tượng nghiên cứu
- Chất kắch kháng: Bion 200ppm, Salicylic Axit 1000ppm, ựồng clorua 0,05mM
- Chế phẩm sinh học: Phytoxin VS.
* Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 9 năm 2010 ựến tháng 6 năm 2011 - địa ựiểm:
+ Xã đông La, huyện Hoài đức và phường Giang Biên, quận Long Biên thành phố Hà Nộị
+ Bộ môn Bệnh cây Ờ Nông dược, Trường đHNN Hà Nộị
3.2 Vât liệu nghiên cứu
- Cây ký chủ: Cây cà chua Mỹ 902 ựược trồng phổ biến tại xã đông La, huyện Hoài đức và cây cà chua HT9 ựược trồng phổ biến tại phường Giang Biên, quận Long Biên thành phố Hà Nộị
- Chất kắch kháng: Bion 200ppm, Salicylic Axit 1000ppm, ựồng clorua 0,05mM
- Chế phẩm sinh học: Phytoxin VS.
- Mẫu bệnh thu thập tại xã đông La, huyện Hoài đức, và phường Giang Biên, quận Long Biên thành phố Hà Nộị
- Môi trường nuôi cấy và phân lập nấm bệnh: WA, PDẠ
3.3 Dụng cụ thắ nghiệm
- Dụng cụ thắ nghiệm gồm các dụng cụ cần thiết trong phòng thắ nghiệm như: Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm, ựèn cồn, giấy thấm vô trùng, bình tam
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 21 giác, ống nghiệm, ựĩa petri, que khều nấm, lò vi sóng, tủ lạnh, tủ ựịnh ôn, nồi hấp, bếp ựiện và các hóa chất khử trùng Ầ
- Bình bơm thuốc của nông dân.
3.4 Nội dung nghiên cứu
- điều tra thành phần bệnh hại cà chua, diễn biến của một số nấm bệnh gây hại chắnh, ựặc biệt là bệnh ựốm vòng do nấm Alternariạ solani gây ra trên cây cà chua tại phường Gian Biên, quận Long Biên và xã đông La, huyện Hoài đức, Hà Nội vụ xuân hè năm 2011.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất Bion, Salicylic acid, CuCl2 và chế phẩm sinh học Phytoxin VS ựến khả năng phát sinh phát triển của nấm bệnh, ựặc biệt là bệnh ựốm vòng do nấm Alternaria solani gây ra trên cây cà chua trong và ngoài nhà lướị
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp ựiều tra ngoài ựồng ruộng
điều tra bệnh hại theo phương pháp của Cục Bảo vệ thực vật, điều tra ựịnh kỳ 7 ngày/1 lần.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng
3.5.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Chọn ruộng bị bệnh, thu thập những cây có triệu chứng bệnh ựiển hình. Tất cả các mẫu thu thập ựược ựều ghi rõ tên cây, ngày ựiều tra và ựịa ựiểm thu mẫụ
3.5.2.2. Phương pháp ựể ẩm
Sau khi ựiều tra thu thập ựược mẫu bệnh (lá, thân, quả) ngoài ựồng ruộng chọn mẫu bệnh có triệu chứng ựiển hình, rửa sạch ựất cát, cắt thành mẫu thắch hợp ựể trong hộp Petri có lót giấy ẩm, ựể ở nhiệt ựộ thắch hợp sau 2 - 3 ngày, ựem kiểm tra dưới kắnh hiển vi ựể xác ựịnh sơ bộ tác nhân gây bệnh.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 22
3.5.2.3. Phương pháp nấu môi trường
Môi trường PDA:
- Thành phần: 200g khoai tây, 20g Dextrose, 20g Agar, 1 lắt nước cất.
- điều chế môi trường: Khoai tây rửa sạch gọt vỏ, cắt nhỏ, ựun trong nước 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung thêm nước cho ựủ 1000ml. Lấy dung dịch ựã lọc tiếp tục ựun sôi, cho Dextrose và Agar vào khuấy tan, ựổ môi trường ra bình tam giác ựã sấy khô, dùng giấy bạc ựậy kắn nắp. Sau ựó, ựem khử trùng trong nồi hấp ở 1210C trong 30 phút.
- Thêm vào kháng sinh streptomycin trước khi rót môi trường ra ựĩa ựể ức chế vi khuẩn. Sau khi thạch nguội bọc vào túi nilon bảo quản ở ngăn dưới tủ lạnh.
Môi trường WA:
- Thành phần: 15g agar, 1 lắt nước cất.
- điều chế môi trường: đun sôi 1 lắt nước cất, them vào 15g agar, quấy ựều, ựổ môi trường ra bình tam giác ựã sấy khô dùng giấy bạc ựậy kắn nắp. Sau ựó, ựem khử trùng trong nồi hấp ở 1210C trong 30 phút.
- Thêm kháng sinh streptomycin, rót môi trường ra ựĩa, ựể nguội ựem bảo quản trong tủ lạnh.
3.5.2.4. Phương pháp giám ựịnh mẫu
Quan sát nấm dưới kắnh hiển vi, chụp ảnh và ựo kắch thước sợi nấm, bào tử nấm, Quan sát màu sắc bào tử, tản nấm trên môi trường PGA, Từ ựó tra tài liệu giám ựịnh ựể xác ựịnh loài nấm ựang nghiên cứụ
3.5.2.5. Phương pháp phân lập mẫu bệnh
- Mẫu bệnh thu ngoài ựồng phải là những mẫu ựiển hình, mới, còn tươị Rửa sạch mẫu bệnh ựể loại bỏ ựất bụi và các tạp chất khác. Sau khi rửa sạch, cắt những mẫu bệnh thành những ựoạn ngắn 1 Ờ 3cm gồm cả mô bệnh và mô khỏẹ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 23 - Lau sạch bàn làm việc bằng cồn 70%.
- Nhúng panh và dao mổ trong cồn và hơ trên ngọn lửa ựèn cồn. đồng thời nhúng nhanh mẫu bệnh vào trong cồn 70%, rửa lại trong nước vô trùng và ựể khô trên giấy thấm vô trùng.
- Dùng dụng cụ ựã khử trùng cắt những vết bệnh nhỏ (2x2mm) từ phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, sau ựó cấy lên trên môi trường WA (5 miếng 1 ựĩa 90cm) ựặt những miếng cấy gần mép ựĩạ
- đặt ựĩa cấy ở 250C trong ựiều kiện ánh sáng.
- Khi nấm phát triển cách miếng mô bệnh từ 1 - 2cm, cắt ựỉnh sinh trưởng cấy truyền sang môi trường PGA ựể tiến hành giám ựịnh.
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu trong nhà lưới