a. Thí nghiệm 1: Khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi pmi trên các loại cây trồng
4.3Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi CryIA(b)
Từ kết quả của thí nghiệm về sự chuyên biệt của mồi 35S, do có hai đối tượng là bắp, đậu nành vẫn chưa đủ cơ sở để kết luận. Nên thí nghiệm đánh giá tính chuyên biệt của cặp mồi CryIA(b) đã được thực hiện.
Được biết cặp mồi CryIA(b) sử dụng để phát hiện gen Bt kháng sâu đục thân và phần lớn bắp, đậu nành chuyển gen đều có chưa gen này. Cặp mồi này khuếch đại một đoạn DNA có kích thước khoảng 184bp khi điện di trên gel 2%. Kết quả PCR với
thành phần phản ứng ở Bảng 4 và tại nhiệt độ bắt cặp 580C cho thấy các giống đậu
nành không xuất hiện band 184bp trong khi các giống bắp đều xuất hiện band khoảng
184bp. Với kết quả này có thể kết luận giống bắp siêu ngọt có khả năng rất lớn là bắp
Hình 13: Kết quả PCR với cặp mồi CryIA(b)
Giếng M: thang chuẩn 100bp; giếng 1: đậu nành ST4; giếng 2: đậu nành CM60; giếng 3: đậu nành HL203; giếng 4-6: bắp; giếng 7: nước.
M 1 2 3 4 5 6 7
200bp
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Trong quá trình khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi đã được dùng để phát hiện
cây GM (cặp mồi CryIA(b)) cũng như các cặp mồi được thiết kế trong nghiên cứu này
bằng phảnứng PCR trên nhiều đối tượng khác nhau như: lúa, thuốc lá, đậu nành, bắp, đậu xanh,... Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose, nhận thấy:
Cặp mồi Pmi 1 được thiết kế nhưng không hiệu quả trong việc nhận diện GM. Cặp mồi Pmi 2 được thiết kế đặc hiệu với thuốc lá, cam sành: đối với thuốc lá chuyển gen sẽ khuếch đại được band 850bp còn ở thuốc lá tự nhiên không khuếch đại được band này. Và không đặc hiệu với các đối tượng được nghiên cứu khác.
Cặp mồi 35S có tính đặc hiệu cao đối với lúa và thuốc lá, có sản phẩm khuếch đại 200bp ở lúa và thuốc lá chuyển gen, còn ở giống tự nhiên thì không có band này. Với đậu nành, bắp, thì chưa có nguồn gen làm đối chứng, nên chỉ có thể kết luận là hai giống này có khả năng chuyển gen.
Cặp mồi CryIA(b) rất đặc hiệu đối với bắp, và không đặc hiệu với các đối tượng khác: lúa, thuốc lá, đậu nành, đu đủ, cam, bưởi… Cặp mồi này khuếch đại được
band 184 bp ở bắp, tuy nhiên không xuất hiện band đối với đậu nành và các đối tượng
khác. Như vậy có thể kết luận bắp siêu ngọt có khả năng rất lớn là giống GM
5.2. Đề nghị
Bổ sung nguồn giống tự nhiên đối với hai đối tượng đậu nành, bắp để có đủ cơ sở nhận diện có phải cây GM hay không.
Tiếp tục tối ưu điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CryIA(b), khảo sát nhiệt độ gắn mồi và thành phần hóa chất trong quá trình thực hiện phản ứng PCR
Nên tiến hành khảo sát một số cặp mồi khác cũng thường dùng để phát hiện cây
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Lê Trần Bình, Nguyễn Đình Thi. 2008. Cơ sở Công nghệ Sinh học tập 1 – Công
nghệ gen. Nxb giáo dục
Nguyễn Đức Lượng, 2001. Công nghệ Sinh học. Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
Trần Nhân Dũng, Nguyễn Thị Pha, Đỗ Tấn Khang. 2012. Công nghệ di truyền. Nxb Đại học Cần Thơ.
Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ. 2006. Giáo trình công nghệ chuyển gene. Nxb Huế.
Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ.2010. Công nghệ chuyển gen.
Nxb Huế.
Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung. 2006. Công nghệ gen trong nông nghiệp. Nxb Nông nghiệp.
Trần Thị Tuyết Linh .2009. Cây trồng biến đổi gen. Thông tin KH&CN Trà
Vinh, số 2/2009.
Tiếng Anh
Ahmed FE (2002). Detection of genetically modified organisms in foods. Trends
Biotechnol. 20: pp215-223.
Battraw MJ, Hall TC. 1990. Histochemical analysis of CAMV 35S promoter-
beta-glucuronidase gene expression in transgenic rice plant. Plant Mol
Biol. 1990 Oct;15(4):527-38.
Benfey PN, Chua NH. 1989. Regulated genes in transgentic plant. Science. 1989
Apr 14;244(4901):174-81.
Blowers AD, Bogorad L, Shark KB, Sanford JC. Studies on Chlamydomonas chloroplast transformation: foreign DNA can be stably maintained in the
chromosome. Plant Cell. 1989 Jan;1(1):123-32.
Boynton J.E., N.W Gillham., E.H Harris., J.P Hosler., A.M Johnson, A.R. Jones, B.L. Randolph - Anderson, D. Robertson, T.M. Klein, K.B Shark and
Sanford J.C.., 1988. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with
high velocity microprojectiles. Science 240: 1534 – 1538.
Clive James, 2012. 2012 ISAAA Report on Global Status of Biotech /GM crops.
Dale P.J, 1992. Spread of engineered genes to wild relatives. Plant Physiol 100,
pp. 13-15.
Daniell H, 1999. Environment friendly approaches to genetic engineering. In
Vitro Cell D v. Biol. Plant 35, pp. 361-368.
David M, Hillis, Craig Moritz, Barbara K, Mabl. Molecular systematics (Second
edition).
Dekeyser R, Claes B, Marichal M, Van Montagu M, caplan A,1989. Evaluation
of selectable markers for rice transformation. Plant Physiol. May; 90(1):
217 - 23
Horsch RB, Rogers SG, Fraley RT. 1985. Transgenic plants
Ingebrecht IL et at. Plant cell. 1989. Different 3’ end regions strongly influence
the level of gene expression plant cell’s.
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions: beta-glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO
J. 1987 Dec 20;6(13):3901-7.
Jeschke JM, Keesing F, Ostfeld RS, 2013. Novel organisms: comparing invasive
species, GMOs, and emerging pathogens. Ambio. 2013 Sep;42(5):541-8.
doi: 10.1007/s13280-013-0387-5. Epub 2013 Mar 3.
Kramkowska M, 2013. Benefits and risks associated with genetically modified
food products. Ann Agric Environ Med. 2013;20(3):413-9.
Malik V.S and Saroha M.K, 1999. Marker gene controversy in transgenic plants.
J. Plant Biochem. Biotechnol 8, pp. 1-13.
Miles J.S and Guest J.R, 1984. Nucleotide sequence and transcriptional star point
of the phosphomannose isomerase gene (mana) of Escherichia coli. Gene
32, pp. 41-48.
Pego V. P. , Weisbeek P. J.,Smeekens S. C .M. , 1999. Mannose inhibits
Arabidopsis germination via a hexokinase-mediated step. Plant physiol
R. H. Phipps and J. R. Park, 2002. Environmental Benefits of Genetically Modified Crops: Global and European Perspectives on Their Ability to
Reduce Pesticide Use. Journal of Animal and Feed Sciences, 2002. Vol.11,
pages 1-18.
Tengel C., Schuβler P., Setzke E., Balles J. and Sprenger-Hauβels M. (2001)
PCR-based detection of genetically modified soybean and maize in raw and
highly processed foodstuffs, BioTechniques 31, 426–429
Tepfer, M; Gaubert, S; leroux-Coyau, M; Prince, S; Houdebine, LM, 2004. Transient expression in mammalian cells of transgenes transcriped from the
Cauliflower mosaic virus 35S promoter. Environ Biosafety Res (2): 91-
7.PMID 15612506
Van Maris AJ, Winkler AA, Kuyper M, de Laat WT, van Dijken JP, Pronk JT. Development of efficient xylose fermentation in Saccharomyces cerevisiae:
xylose isomerase as a key component. Adv Biochem Eng
Biotechnol. 2007;108:179-204.
WHO, 1993. Health aspects of marker genes in genetically modified plants. Report of a WHO workshop of the Food Safety Unit.
Trang web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://nongnghiep.vn, ngày 02/08/2013. http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/44/executivesummary, ngày 02/08/2013 http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-xa-hoi/cong-nghe-chuyen-gen-o-thuc- vat.html, ngày 02/08/2013. http://vndocs.docdat.com/docs/index-2391.html?page=8, ngày 02/08/2013 http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/194.docu.ht ml, ngày 02/08/2013.
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình điện di sản phẩm PCR
Hình 14: Hình điện di sản phẩm PCR chạy với cặp mồi 35S promoter ở 580C, 16 mẫu
Giếng 1: lúa chuyển gen; giếng 2: lúa; giếng 3: thuốc lá chuyển gen; giếng 4: cam sành; giếng 5:cam cười; giếng 6: cam Ari20na; giếng 7: bưởi; giếng 8: bưởi 5 roi; giếng 9: cẩm thạch; giếng 10: chuối; giếng 11: nguyệt quế; giếng 12: đậu nành CM60; giếng 13: đậu xanh;giếng 14: đậu nành ST4; giếng 15: đậu nành HL92; giếng 16: nước cất 2 lần; giếng M: thang chuẩn
Hình 15: Hình điện di sản phẩm PCR chạy với cặp mồi 35S promoter ở 580C, 11 mẫu
Giếng M: thang chuẩn; giếng 2: đối chứng +; giếng 3: lúa chuyển gen; giếng 4: đậu nành CM60; giếng 5,6,7: đu đủ; giếng 8: thuốc lá chuyển gen, giếng 9,10,11: đu đủ; giếng 12: nước cất 2 lần)
200bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
200bp
Hình 16: Kết quả PCR với cặp mồi Cry ở 570C
Giếng 1: đối chứng (+); giếng 2: lúa chứa GMO; giếng 3:lúa: giếng 4: Thuốc lá; giếng 5: thuốc lá chứa GMO; giếng 6: cam sành; giếng 7: cam cười; giếng 8: bưởi 5 roi; giếng 9: cẩm thạch; giếng 10: chuối; giếng 11: nguyệt quế; giếng 12: đậu nành HL203; giếng 13: đậu nành ST4; giếng 14: đậu xanh; giếng 15: nước cất khử trùng 2 lần( đối chứng (-); giếng M: Thang chuẩn
Hình 17: Kết quả PCR với cặp mồi Cry ở 60oC
Giếng 1: đối chứng (+); giếng 2: lúa chứa GMO; giếng 3:lúa: giếng 4: Thuốc lá; giếng M: Thang chuẩn; giếng 5: thuốc lá chứa GMO; giếng 6: cam sành; giếng 7: cam cười; giếng 8: bưởi 5 roi; giếng 9: cẩm thạch; giếng 10: chuối; giếng 11: nguyệt quế; giếng 12: đậu nành HL203; giếng 13:nước cất khử trùng 2 lần( đối chứng (-);
200bp Khoảng 184bp 200bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Phụ lục 2: Kết quả kiểm tra cây GM trên các đối tượng nghiên cứu
Kết quả phân tích
STT Mẫu DNA Nguồn gốc
Pmi 1 Pmi 2 35S Cry
1 Lúa chuyển gen Viện CNSH- ĐHCT - + + -
2 Lúa Taipei 309 Viện CNSH- ĐHCT - + + -
3 Lúa Nipponbare Viện CNSH- ĐHCT - + - -
4 Thuốc lá chuyển gen Viện CNSH- ĐHCT - + + -
5 Thuốc lá Viện CNSH- ĐHCT - - - -
6 Cam sành Viện CNSH- ĐHCT - - + -
7 Cam cười Viện CNSH- ĐHCT - + + -
8 Cam ari 20na Viện CNSH- ĐHCT - + + -
9 Bưởi 5 roi Viện CNSH- ĐHCT - + + - 10 Cẩm thạch Viện CNSH- ĐHCT - + + - 11 Chuối Viện CNSH- ĐHCT - + + - 12 Nguyệt quế Viện CNSH- ĐHCT - + - - 13 Đậu nành HL203 Viện CNSH- ĐHCT - + + - 14 Đậu nành ST4 Viện CNSH- ĐHCT - + - - 15 Đậu xanh Viện CNSH- ĐHCT - + - - 16 Đu đủ Chợ Cần Thơ - + + -
17 Bắp Siêu thị Vinatex Cần Thơ - + + +
(Trong đó:
+: có sản phẩm khuếch đại
Phụ lục 3: Hình thiết bị
Hình 15: Máy microwave Hình 16: Máy PCR
Hình 17: Máy chụp hình gel Hình 18: Bể điện di BIO-RAD UV 2000.