2.4.2.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Phương phỏp nhuộm hoỏ mụ miễn dịch được thực hiện trờn cỏc lỏt cắt
mụ vựi nến bằng bằng kỹ thuật enzym Avidin Biotin Complex (ABC).
Bộc lộ
Bộc lộ ––Kết hợp Kết hợp ––Khuyếch Khuyếch đạiđại
Kh Khááng thể ng thể IIII gắn biotin gắn biotin Kh Khááng thể ng thể II Kh
Khááng nguyng nguyênên Biotin Biotin Avidin Avidin Men Men Bệnh phẩm
Bệnh phẩm đưđược cố ợc cố đđịnh formolịnh formol
Bảng 2.3. Cỏc khỏng thể sử dụng trong nghiờn cứu
Tờn khỏng thể Hóng sản xuất Nồng độ
Monoclonal Mouse Anti-Human CK7 Clone OV-TL-1200
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human CK20 Clone Ks 20.8
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human p53 protein Clone DO-7
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 antigen Clone MIB-1
Dako 1/100
Polyclonal Rabit Anti-Human C-erbB-2 Oncoprotein
Dako 1/100
Polyclonal Rabit Anti-Human MUC-1 Clone Ab15418
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human MUC-2 Clone CCP58
Dako 1/25
Rabit Monoclonal Antibody Cytokeratin 19 A53-B/A2.26
Cell marquer 1/100
Rabit Monoclonal Antibody CDX-2 EPR2764Y
Cell marquer 1/100
2.4.2.2 Quy trỡnh xử lý tiờu bản hoỏ mụ miễn dịch
Quy trỡnh xử lý tiờu bản hoỏ mụ miễn dịch theo cỏc bước sau:
- Sử dụng kỹ thuật Biotin - Avidin Complex (ABC). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.Bệnh phẩm được cắt dày 4m, dàn trờn cỏc lam kớnh phủ silane.
2.Ủ qua đờm ở nhiệt độ 56C.
4.Rửa nước x 5 phỳt.
5.Bộc lộ khỏng nguyờn bằng nhiệt: đặt tiờu bản trong dung dịch citrate
nồng độ 0,01mol/l, pH = 6,0, đun sụi trong nồi ỏp suất x 5 phỳt.
6.Rửa nước cất x 5 phỳt.
7.Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 x 10 phỳt. 8.Rửa nước cất x 5 phỳt. 9.Ủ khỏng thể thứ nhất 1 giờ. 10.Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phỳt. 11.Ủ khỏng thể thứ hai 30 phỳt. 12.Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phỳt 13.Phủ ABC x 30 phỳt 14.Rửa TBS 3 lần x 5 phỳt 15. Ủ với DAB x 10 phỳt.
16.Rửa nước chảy x 5 phỳt.
17.Nhuộm nhõn với Hematoxylin x 30 giõy. 18.Tẩy nước, phủ lamen.
Kết quả nhuộm
Âm tớnh: chỉ cú màu xanh tớm của Hematoxylin nhuộm nhõn.
Dương tớnh: nếu cú hiện diện khỏng nguyờn trờn tế bào sẽ cú màu vàng nõu.
2.4.2.3. Điều kiện đọc kết quả
+ Cú tiờu bản chứng õm (trong quỏ trỡnh nhuộm bỏ qua giai đoạn phủ
khỏng thể thứ nhất) và chứng dương (nhuộm kốm với tiờu bản mụ đó biết
chắc chắn là dương tớnh), cú thể dựng chứng dương ngay trong tiờu bản
+ Phải đối chiếu với tiờu bản nhuộm HE để biết vựng cần đọc kết quả là vựng nào.
+ Biết rừ vị trớ khỏng nguyờn cần xỏc định ở nhõn, bào tương hay màng
tế bào.
2.4.2.4. Cỏch đọc kết quả
- Bộc lộ CK7, CK19 và CK20
Phản ứng dương tớnh thể hiện bằng màu nõu đỏ ở bào tương tế bào ở ≥
10% tế bào.
- Bộc lộ CDX-2
Dựa vào cường độ bắt màu của nhõn và tỷ lệ cỏc tế bào dương tớnh.
Biểu hiện dương tớnh khi nhõn tế bào cú màu vàng nõu. Phản ứng dương tớnh
nếu trờn 10% nhõn tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới kớnh hiển
vi quang học
- Bộc lộ MUC-1
MUC-1 dương tớnh khi cú màu nõu đỏ của chất nhầy trong lũng tuyến, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dạng màng ở cực đỉnh tế bào và bào tương tế bào. MUC-2 cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào.
- Bộc lộ MUC-2
MUC-2 dương tớnh khi cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào.
- Bộc lộ p53
Dựa vào cường độ bắt màu của nhõn và tỷ lệ cỏc tế bào dương tớnh. Biểu
hiện dương tớnh khi nhõn tế bào cú màu nõu đỏ, kết quả õm tớnh khi nhõn tế
bào khụng bắt màu vàng nõu. Phản ứng dương tớnh nếu trờn 10% nhõn tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới kớnh hiển vi quang học
- Bộc lộ Ki-67
Biểu hiện dương tớnh khi nhõn tế bào cú màu nõu đỏ, kết quả õm tớnh khi
nhõn tế bào khụng bắt màu nõu đỏ. Phản ứng dương tớnh nếu trờn 10% nhõn tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới kớnh hiển vi quang học
- Bộc lộ của Her-2/neu
Kết quả dương tinh đối với Her -2/neu được đỏnh giỏ theo tiờu chuẩn
của nhà sản xuất Dako.
Sử dụng khỏng thể đa dũng khỏng Her -2/neu, pha loóng 1/200.
Sử dụng mụ đại tràng lành, vựng cạnh u làm chứng õm, sử dụng một
tiờu bản đó chắc chắn là dương tớnh là chứng dương
Đọc tiờu bản trờn kớnh hiển vi quang học để đỏnh giỏ cường độ bắt màu của màng bào tương và tớnh tỷ lệ cỏc tế bào dương tớnh với Her-2/neu.
Phản ứng dương tớnh ở màng tế bào và được chia làm bốn mức: õm tớnh, 1+,
2+ và 3+. Phản ứng chỉ được coi là dương tớnh thực sự ở mức 3+.
Bảng dưới đõy là thang điểm đỏnh giỏ kết quả nhuộm Her-2/neu
Bảng 2.4. Thangđiểm đỏnh giỏ kết quả nhuộm Her-2/neu trờn HMMD
Thang điểm Đỏnh giỏ sự biểu
lộ protein HER2 Bệnh phẩm phẫu thuật
0 Âm tớnh Khụng phản ứng hoặc nhuộm màng <10% tế bào u
1+ Âm tớnh Nhuộm nhạt màng bào tương >10% cỏc tế
bào u, cỏc tế bào chỉ nhuộm một phần màng bào tương
2+ Nghi ngờ Nhuộm yếu- vừa, hoàn toàn đỏy bờn hoặc
bờn màng tế bào≥ 10% tế bào u.
3+ Dương tớnh Nhuộm đậm, hoàn toàn đỏy bờn hoặc bờn màng tế bào ≥ 10% tế bào u.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});