1.5.1.1 Khỏi niệm: HMMD là một kỹ thuật nhuộm đặc biệt, sử dụng khỏng
thể (KT) đặc hiệu để xỏc định sự hiện diện của cỏc khỏng nguyờn (KN) tương ứng trờn cỏc lỏt cắt mụ học hoặc trờn cỏc loại tế bào cú trong mụ [69].
Nguyờn tắc: cho KT đặc hiệu lờn mụ, nếu trong mụ cú KN sẽ cú phản ứng kết
hợp KN - KT. Cú 2 cỏch quan sỏt phức hợp này:
+ Miễn dịch huỳnh quang: KT được gắn với một chất phỏt huỳnh quang
(quan sỏt kết quả dưới kớnh hiển vi huỳnh quang).
+ Miễn dịch men: KT được gắn với một vài loại men, men này xỳc tỏc cho một phản ứng húa học để chuyển một chất khụng màu thành một chất cú màu (quan sỏt được dưới kớnh hiển vi quang học).
Khỏng nguyờn: cỏc KN thường là cỏc protein, một số khỏc là carbohydrate, cú thể từ ngoài cơ thể vào (vi khuẩn, độc tố, virus,…) hoặc từ trong cơ thể (cỏc tơ trung gian, cỏc thụ thể hormon, cỏc protein là sản phẩm của đột biến
gen…, cú thể hiện diện ở bào tương, màng tế bào hoặc nhõn) [69].
Quyết định KN (epitope) là một phần nhỏ của KN, nơi tiếp xỳc với KT.
biệt. Trong qui trỡnh nhuộm HMMD, cần bộc lộ epitope trước khi cho tiếp
xỳc với KT.
Khỏng thể: là cỏc protein nhận biết và kết nối với KN đặc hiệu, được
sản xuất từ sự đỏp ứng với biểu hiện của KN. Mỗi KT cú ớt nhất hai vị trớ kết
nối KN.
KT chủ yếu là IgG, tiếp đến là IgM. KT kết hợp trực tiếp với KN gọi là KT thứ nhất. Tuỳ theo cỏch sản xuất, cú 2 loại KT:
+ KT đa dũng: được sản xuất bằng cỏch gõy miễn dịch ở động vật với KN đặc hiệu. Động vật đỏp ứng miễn dịch và tạo ra khỏng huyết thanh bao
gồm nhiều loại KT đặc hiệu và khụng đặc hiệu. Sau đú KT được làm tinh khiết (loại bỏ cỏc KT khụng cần thiết). KT đa dũng cú thể kết hợp với nhiều
vị trớ của một KN nờn độ nhạy cao, tăng khả năng phỏt hiện. Tuy nhiờn KT đa
dũng cú thể chứa cỏc KT phản ứng khụng đặc hiệu với cỏc KN nờn cú khuynh
hướng nhuộm nền cao.
+ KT đơn dũng: được sản xuất bằng kỹ thuật u lai, phối hợp khả năng
tạo KT đặc hiệu từ tương bào với lympho bào B ở lỏch động vật được gõy
miễn dịch, hỡnh thành nhiều dũng tế bào u lai sản xuất ra KT đặc hiệu. Cỏc tế bào này được lựa chọn và nhõn giống trong mụi trường nuụi cấy tế bào. KT
đơn dũng được sản xuất ra từ một dũng của tế bào u lai nờn rất tinh khiết, chỉ
phản ứng với một loại quyết định KN. Tuy nhiờn, vỡ KT đơn dũng chỉ phản ứng với một vị trớ đặc hiệu chứ khụng phải toàn bộ KN nờn ớt nhậy hơn so với KT đa dũng. Hơn nữa, một số KT đơn dũng chỉ phản ứng được trờn tiờu bản
cắt lạnh [69].
Cấu trỳc của KT cú hỡnh chữ Y với 4 chuỗi protein, gồm 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng. KT cú hai vựng:
+ Vựng ổn định (Fc): phần gốc của chữ Y, đõy là vựng rất quan trọng vỡ cú thể kết nối với bổ thể hay cỏc tế bào.
Hệ thống nhận biết: vỡ cỏc phức hợp KN - KT khụng quan sỏt thấy được dưới kớnh hiển vi quang học nờn cần một hệ thống để hiển thị vị trớ cú
phản ứng KN-KT. Hệ thống này gồm 2 phần: KT thứ 2 (KT bắc cầu) và hệ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thống phúng đại dấu hiệu nhận biết (gồm men, cỏc phõn tử phỏt hiện, chất kết
nối và chất màu).
+ Khỏng thể thứ hai (KT bắc cầu, KT kết nối): là KT phản ứng đặc hiệu
với KT thứ nhất sau khi KT này đó gắn với KN. Nú phản ứng với phõn tử
globulin miễn dịch huyết thanh của động vật mà đó sản xuất KT thứ nhất. KT
thứ hai thường được gắn biotin và được coi như kớt phỏt hiện chung.
+ Cỏc enzym: enzym là một protein gõy ra sự thay đổi hoỏ học của
cỏc chất khỏc nhưng bản thõn nú khụng thay đổi, enzym đúng vai trũ như
chất chỉ điểm. Trong kỹ thuật HMMD, enzym cần phải đảm bảo được cỏc điều kiện sau:
- Phải tạo ra một sản phẩm phản ứng mà khụng thể hoà tan, màu rừ ràng, kết tủa trực tiếp tại sản phẩm đú.
- Phải được bền vững ở nhiệt độ phũng, cú thể sản xuất được nhiều và cú thể duy trỡ hầu hết cỏc hoạt động của nú sau khi đó kết nối.
Chỉ cú một vài loại enzym đỏp ứng được những nhu cầu trờn, hai loại enzym được sử dụng rộng rói do sản xuất dễ và giỏ thành thấp là peroxydase,
được chiết xuất từ rễ cõy cải ngựa và phosphatase kiềm (Alkaline
phosphatase), chiết xuất từ E.Coli hoặc từ đại tràng.
+ Cỏc phõn tử phỏt hiện: protein A, biotin và avidin là những phõn tử
phỏt hiện. Cỏc IgG hoặc những đoạn của nú phải ở dạng đó được tinh chế. Sự
sử dụng như một chất khởi động. Cần lưu ý, cỏc KT khụng được lẫn với cỏc
protein, cỏc peptid hoặc những chất khỏc cú chứa nhúm amino[69] Chất kết nối: những chất này phải cú hai chức năng:
- Cú thể phản ứng với men.
- Phản ứng đồng thời hoặc tiếp theo với phõn tử phỏt hiện để hỡnh thành cầu nối giữa cỏc khỏng thể.
Sự kết nối hoỏ học gõy nờn bởi cầu nối này phải khụng bị thay đổi và khụng bị phỏ huỷ bởi cỏc hoạt động của men và của khỏng thể. Càng giữ cho
hoạt động sinh học của cỏc thành phần này tốt thỡ quỏ trỡnh kết nối càng được
thực hiện tốt.
+ Chất tạo hợp chất màu: dựng để tạo ra một sản màu tại vị trớ kết hợp
KN-KT mà cú thể quan sỏt được trờn kớnh hiển vi quang học. Phản ứng này cũng để chứng minh sự cú mặt của men. Hiện nay, cỏc phũng xột nghiệm HMMD thường sử dụng diaminobenzidine (DAB), loại này tạo ra một sản
phẩm màu nõu, bền vững trong nhiều năm. Ngoài ra, người ta cũn sử dụng
3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), tạo ra sản phẩm màu đỏ mà khụng bị
nhầm với sắc tố melanin, vỡ vậy AEC hay được dựng trong cỏc bệnh của
da. AEC hay bị hoà tan trong cỏc dung mụi của mụ, vỡ thế phải cần một số
vật liệu đặc biệt cho việc gắn. Mặt khỏc, sản phẩm màu của AEC khụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bền vững, dễ bị phai màu theo thời gian và nú cũng là một chất cú thể gõy
ung thư nờn AEC ớt được sử dụng hơn DAB. Hiện nay cũng cú một số chất
tạo màu đưa ra những sản phẩm phản ứng màu khỏc như chloronaphthol để
tạo ra sản phẩm màu xanh[69].
1.5.1.2. Cỏc kỹ thuật nhuộm miễn dịch men [69].
+ Miễn dịch men trực tiếp: KN mụ kết hợp với KT thứ nhất cú gắn men, phương phỏp này đơn giản, nhanh, cú tớnh đặc hiệu nhưng ớt nhạy do thiếu hệ
+ Miễn dịch men giỏn tiếp (phương phỏp cầu nối): gồm KN mụ + KT
thứ nhất + KT thứ hai (khỏng Ig loài của KT thứ nhất) gắn với hệ thống phúng đại dấu hiệu nhận biết.
Hiện nay cú nhiều phương phỏp nhuộm húa mụ miễn dịch tựy thuộc vào
điều kiện của cỏc phũng xột nghiệm Giải phẫu bệnh và sự quen dựng của cỏc
kỹ thuật viờn, trong đú phương phỏp miễn dịch men giỏn tiếp tỏ ra cú nhiều ưu điểm hơn so với phương phỏp gắn trực tiếp:
+ Cú thể dựng nhiều loại KT thứ nhất khỏc nhau.
+ Hệ thúng phúng đại dấu hiệu nhận biết chỉ gắn với KT thứ hai và cú thể tạo ra nhiều vị trớ gắn phức hợp nhận biết trờn KT thứ hai.
+ KT thứ nhất thường được pha loóng hơn, do đú giảm nhuộm nền hơn. Cỏc phương phỏp thường dựng là:
+ Phương phỏp men chống men (Peroxydase-antiperoxydase): KN mụ + KT thứ nhất + KT thứ hai gắn phức hợp men chống men (peroxydase- antiperoxydase)
+ Phương phỏp cầu nối Avidin-Biotin (Avidin-Biotin conjugate),
(phương phỏp ABC): KN mụ + KT thứ nhất + KT thứ hai gắn phức hợp
Avidin, Biotin và peroxydase.
+ Phương phỏp cầu nối Biotin-streptavidin: KN mụ + KT thứ nhất + KT
thứ hai gắn phức hợp Biotin, Streptavidin và peroxydase.
+ Phương phỏp phosphatase kiềm - khỏng phosphatase kiềm (Alkaline
phosphatase - antialkaline phosphatase) (phương phỏp APAAP).
Thực tế cho thấy rằng với những u đặc thỡ nhuộm bằng phương phỏp ABC cú độ nhạy cao hơn, ớt gõy nhuộm nền hơn so với cỏc phương phỏp
khỏc. Phương phỏp APAAP hay dựng với cỏc tiờu bản mỏu hoặc dịch tõn
1.5.1.3. Yờu cầu: Một chất được định vị trong mụ trờn HMMD phải cú cỏc
- Chất đú đó tinh chế sẵn dưới dạng khỏng nguyờn tương đối thuần khiết (để sản xuất khỏng thể đặc hiệu).
- Sự bảo toàn (ớt nhất một phần) của chất khỏng nguyờn muốn định vị
trong quỏ trỡnh thao tỏc kỹ thuật mụ học và HMMD.
Khi hai điều trờn được tụn trọng, kỹ thuật HMMD cú thể được thực hiện
cú hiệu quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.5.1.4. Phương phỏp:
- Vật liệu khỏng nguyờn (KN) cú mặt trong một mụ và đặc biệt hơn trong
một lỏt cắt mụ phản ứng đặc hiệu với một khỏng thể (KT) chống lại nú. Phản ứng miễn dịch này gõy một lắng đọng của một KT đặc hiệu trờn vựng mụ cú KN. Khỏng thể này được gắn với một enzyme, ban đầu người ta gắn với phosphatase acid, nhưng sự kết gắn này khú và khụng ổn định. Hiện nay người
ta gắn với peroxydase ổn định hơn và cú thể bảo quản lõu hơn ở 40C [69].
- Trong kỹ thuật miễn dịch men avidin - biotin, ỏi lực cao giữa avidin với biotin được sử dụng để ghộp cặp peroxidase đỏnh dấu với khỏng thể thứ nhất. Cú cỏc phương phỏp khỏc nhau được sử dụng để làm tăng độ nhạy của kỹ
thuật [76], [77], [78]. Mục đớch của nú là bộc lộ vị trớ KN (epitope), nú cú thể
bị che đậy, vỡ vậy người ta gọi bước này là “bộc lộ KN” hoặc “phục hồi KN”.
Kỹ thuật này cú thể là làm tiờu với nhiều loại enzyme tiờu protein, sử lý bằng
lũ vi súng hoặc cho tiếp xỳc với tỏc động kết hợp của nhiệt và ỏp suất trong
một nồi ỏp suất.
HMMD đó thay thế nhiều KT thường qui và ở chừng mực nhất định, đó cú nhiều ỏp dụng chẩn đoỏn trờn kớnh hiển vi điện tử. Tuy thế, giống như cỏc kỹ thuật khỏc, cũng cú nhiều cạm bẫy, đú là hoạt động của
peroxydase nội sinh và nhuộm nền. Để loại bỏ cỏc yếu tố này, cú hai điều
peoxide (H2O2) và pha loóng KT ở nồng độ loóng tối ưu nhất[69]. Cần tiến
hành cỏc kỹ thuật một cỏch tỷ mỉ, kiểm tra thường xuyờn hoạt động khỏng
thể, chứng õm và chứng dương.
Sự kết hợp Khỏng nguyờn - Khỏng thể
Khái niệm HMMD - Khuyếch đại
Kh Kháángngththểểththứứ22 g gắắn biotinn biotin Kh Kháángngththểểththứứ11 Kh Kháángngnguynguyêênn Biotin Biotin Avidin Avidin Enzym Enzym C Cốốđđịnhịnhformalinformalin
Quan niệm HMMD - Phát hiện
C Cơơchấtchất
1.5.1.5. Đỏnh giỏ kết quả nhuộm:
Điều kiện đọc kết quả:
+ Phải cú tiờu bản chứng õm (trong quỏ trỡnh nhuộm bỏ qua giai đoạn
KT thứ nhất) và chứng dương (nhuộm kốm với tiờu bản mụ đó biết chắc chắn là dương tớnh), cú thể dựng chứng dương ngay trong tiờu bản nhuộm, được
gọi là nội chứng.
+ Phải đối chiếu với tiờu bản nhuộm HE để biết vựng cần đọc kết quả là vựng nào.
+ Biết rừ vị trớ KN cần xỏc định ở nhõn, bào tương hay màng tế bào.
Đọc kết quả:
+ Âm tớnh: chỉ cú màu xanh của nhõn.
+ Dương tớnh: màu vàng nõu (nếu dựng màu DAB), màu đỏ (nếu dựng màu AEC), màu xanh (nếu dựng màu chloronaphthol). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.5.1.6. í nghĩa: HMMD cú thể xỏc định những đặc tớnh sau của mụ:
- Cỏc tế bào cú hỡnh thỏi kộm biệt húa hoặc khụng biệt húa, quỏ sản hoặc
tõn sản. Việc xỏc định nguồn gốc mụ học thay đổi tựy loại tế bào và mụ. - Số lượng cỏc thành phần tế bào trong quỏ trỡnh phỏt triển của bệnh.
Mối tương quan giữa tỷ lệ cỏc tế bào mang một loại khỏng nguyờn nào đú cú
thể cú quan hệ với sự tiến triển của bệnh. Tỷ lệ cỏc tế bào u mang cỏc khỏng nguyờn nhất định cú thể dự bỏo cỏc bệnh khỏc nhau, đồng thời cho phộp chẩn đoỏn chớnh xỏc bệnh và cỏc tỏc nhõn nhiễm khuẩn.
- Nồng độ thực tế của cỏc khỏng nguyờn trong tế bào u cú thể dự đoỏn độ
ỏc tớnh của u đú cũng như dự đoỏn sự đỏp ứng của tế bào u với điều trị.
- Xỏc định vị trớ của cỏc khỏng nguyờn và sự phõn bố của nú trong tế bào và tổ chức, từ đú cung cấp cỏc tiờu chuẩn mới cho chẩn đoỏn và đỏnh giỏ