Hầu hết cỏc khối u đại trực tràng cú thể được chẩn đoỏn dễ dàng bằng
cỏch sử dụng cỏc tiờu chớ mụ bệnh học, đảm bảo một phõn loại chớnh xỏc cho
phần lớn cỏc typ vi thể của UTBMTĐTT. Tuy nhiờn, trong một số trường hợp
việc chẩn đoỏn và xỏc định týp mụ học cú thể gặp khú khăn:
- Những tổn thương nghi ngờ di căn từ nơi khỏc đến: đặc biệt là phổi, loại
trừ một đường dũ kết hợp được phủ bởi biểu mụ vảy (thường giống vị trớ
nguồn gốc); và phõn biệt với những ung thư biểu mụ của hậu mụn lan tràn gần vào trực tràng thấp.
- Những typ vi thể hiếm gặp trong UTBMTĐTT.
Những trường hợp trờn cần cú cỏc kỹ thuật phụ trợ như HMMD để hỗ trợ
cho chẩn đoỏn. Nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu đó được thực hiện nhằm xõy
dựng một bảng cỏc KT thớch hợp trong xột nghiệm HMMD để đỏnh giỏ bệnh lý ĐTT. Tuy nhiờn, sử dụng một dấu ấn đơn độc thường khụng mang lại hiệu
quả tối ưu về độ nhạy và độ đặc hiệu. Việc sử dụng hai hay nhiều dấu ấn miễn
dịch thường mang lại hiệu quả tốt và cải thiện độ chớnh xỏc của chẩn đoỏn. Ứng dụng HMMD trong chẩn đoỏn UTBMĐTT nhằm mục đớch:
- Củng cố cho chẩn đoỏn ung thư.
- Chẩn đoỏn sự ỏc tớnh của u như: tăng chỉ số tăng sinh, mất sự bộc lộ của
bcl-2, sự bộc lộ của p53, Ki-67 (xỏc định tiềm năng sinh học của khối u). - Đỏnh giỏ tiờn lượng ung thư .
- Xỏc định nguồn gốc của UTBMĐTT.
- Xỏc định cỏc UTBM vi xõm nhập, phõn biệt với tổn thương thõm nhiễm
1.5.2.1 CK7, CK19, CK20
** Sinh học phõn tử cơ bản của Cytokeratin (CK)
CK là một thành phần của nhúm sợi cú đường kớnh 10 nm, nú là một
thành phần cấu tạo nờn bộ khung tế bào của hầu hết cỏc tế bào Eukaryote. CK là một dũng phức hợp đa gen của cỏc polypeptid, cú trọng lượng
phõn tử (TLPT) từ 40 - 68 kDa. Theo Moll và cs (1992), cú 20 CK đó được
phỏt hiện và được đỏnh số từ CK1 - CK 20. CK được chia thành 2 nhúm:
nhúm ưa acid (lớp 1- thứ họ A) gồm 12 CK (CK 9 - 20) cú TLPT 40-56,5
kDa, nhúm ưa base trung tớnh (lớp 2-thứ họ B) gồm 8 CK (CK 1 - 8) cú TLPT 53-67 kDa. Luụn cú sự ghộp cặp giữa CK của 2 nhúm tạo nờn cỏc dị dimer. Cỏc CK nhúm ưa base trung tớnh thường lớn hơn cỏcCK nhúm ưa acid tương ứng từ 7- 9 kDa. Mỗi tế bào cú từ 2-10 CK khỏc nhau, sự phõn bố của CK
trong tế bào cú thể khỏc nhau tựy thuộc vào loại mụ và giai đoạn biệt húa của
tế bào. Ở hầu hết cỏc tế bào đơn chứa CK, cỏc sợi được sắp xếp ở mắt lưới
của cỏc bú lỏng lẻo. Tuy nhiờn, ở biểu mụ vảy lỏt tầng, cỏc sợi CK được sắp
xếp ở cỏc bú đặc, tơ biểu bỡ, gắn với cỏc cầu nối gian bào.
Sự biểu hiện của cỏc CK khỏc nhau trong cỏc tế bào u, ngoài việc xỏc
định bản chất biểu mụ của tế bào u, cũn cú thể giỳp ớch cho việc phõn biệt
chắc chắn loại mụ học của cỏc u biểu mụ. Sự xuất hiện của CK khụng chỉ ra được nguồn gốc lớp mầm của tế bào u, nhưng nú núi lờn được tỡnh trạng biệt
húa của tế bào [70].
* Sự biểu hiện của CK ở UTBM
Sự bộc lộ CK phản ỏnh cả 2: typ biểu mụ và tỡnh trạng biệt húa, do đú
cú thể cú ớch trong chẩn đoỏn u. Ở khối u của người, CK cú TLPT thấp tập
trung ở những u bắt nguồn từ biểu mụ trụ (UTBM tuyến dạ dày - ruột) và là
CK đầu tiờn xuất hiện trong thời kỳ bào thai; những CK cú TLPT cao thường
loại biểu mụ đơn bộc lộ CK 8, 18, 19 và thường là CK 7, ở u biểu mụ tế bào vảy CK 5, 6, 14, 16, 17 luụn ưu thế, trong khi đú CK 13 cú thể biểu hiện với
phạm vi ớt hơn.
Một số UTBM cú thể mất đi khả năng bộc lộ một hoặc nhiều cỏc CK
được phỏt hiện trong cỏc tổ chức giả định là nguồn gốc. Vớ dụ: UTBM vảy đụi
khi khụng bộc lộ CK13. Cỏc loại UTBM khỏc cú thể bộc lộ cỏc CK nào đú: CK
8, 18, 19 tớp biểu mụ đơn bộc lộ ở UTBM vảy (song vẫn bộc lộ ưu thể loại CK
của nú như CK 5). Cỏc thay đổi tương tự, thậm chớ cú thể gặp ở cỏc tổn thương
loạn sản, sự thay đổi CK cú thể xảy ra sau xạ trị và / hoặc húa trị [71], [72].
* Ứng dụng khỏng thể đơn dũng khỏng CK trong chẩn đoỏn
CK hiện diện trong tất cả cỏc tế bào biểu mụ, chỳng là chỉ điểm đặc hiệu
cao cho UTBM. Cỏc khỏng thể khỏng CK cũng cú thể giỳp phỏt hiện những ổ di căn nhỏ của UTBM. Cỏc khỏng thể đơn dũng đặc hiệu tương ứng cũng được phỏt triển theo sự đa dạng đú và nghiờn cứu đó HMMD chứng tỏ rằng
một vài UTBM cú cỏc CK đặc hiệu.
CK7: Là một polypeptid cú TLPT 54 kDa, phõn bố rộng rói trong loại biểu mụ đơn. Cỏc nghiờn cứu đó chứng minh mối liờn quan giữa sự bộc
lộ CK7 trong biểu mụ bỡnh thường và mụ ung thư của cựng một tổ chức [73]. Theo một số nghiờn cứu, cú thể tới 13% cỏc trường hợp cú thể bộc lộ CK7 và tỷ lệ này khụng phụ thuộc vào vị trớ (nguyờn phỏt so với di căn) và thứ typ
nhầy [73], [74]. Theo nghiờn cứu của Shin và CS (2010) thỡ CK7 biểu hiện dương tớnh thấp (8,7%) trong ung thư đại trực tràng, theo tỏc giả khi CK7 khi
kết hợp với một số dấu ấn khỏc như CK20, CK19 cú giỏ trị trong chẩn đoỏn
phõn biệt cỏc ung thư di căn từ buồng trứng vào đại trực tràng[72].
CK19: Là một polypeptid cú TLPT 40 kDa, nằm ở đoạn nhiễm sắc
thể 17q12-q21, nú cũng phõn bố rộng rói trong loại biểu mụ đơn. Cỏc nghiờn cứu cho thấy CK19 dương tớnh cao trong ung thư biểu mụ đại trực tràng. Đa
số trường hợp là dương tớnh lan toả. CK19 cú tỷ lệ dương tớnh giảm theo mức
giảm của độ biệt hoỏ, điều đú cú nghĩa là sự mất bộc lộ của CK19 thể hiện sự
mất biệt hoỏ của u. Như vậy, CK19 là một dấu ấn húa mụ miễn dịch rất đặc
hiệu trong ung thư biểu mụ tuyến đại trực tràng, nú thường bộc lộ quỏ mức
khoảng 96% [9]. Theo Zhang và Zheng (2010), CK19 biểu lộ dương tớnh ở hầu
hết cỏc ung thư đại trực tràng và sự kết hợp hai dấu nấn CK7(-)/CK19(+) là kiểu hỡnh hoỏ mụ miễn dịch đặc trưng của ung thư biểu mụ đại trực tràng [9].
CK20: Là một polypeptid cú TLPT 46 kDa. Sự tổng hợp CK20 được
phỏt hiện đầu tiờn ở phụi tuần thứ 8 trờn cỏc tế bào biểu mụ đơn trong quỏ
trỡnh phỏt triển niờm mạc ruột. CK20 biểu hiện đặc hiệu nhất trong số biểu mụ đơn nú hầu như đặc hiệu cho cỏc tế bào biểu mụ ruột và dạ dày cũng như cỏc
tế bào Merkel của da. CK20 õm tớnh điển hỡnh với UTBM tế bào vảy [74].
Để tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của CK 7 và CK20 người ta thường sử
dụng kết hợp hai dấu ấn này với nhau để phỏt hiện vị trớ gốc của ung thư biểu
mụ. Sự kết hợp giữa 2 keratin này trong chẩn đoỏn đó mang lại nhiều kết quả
phõn biệt ung thư biểu mụ tuyến của đại tràng với ung thư biểu mụ tuyến
buồng trứng[79]. Shen B (2002) nghiờn cứu 78 trường hợp di căn ung thư
biểu mụ tuyến đến nóo từ vỳ, phổi và đại tràng, tỏc giả sử dụng kết hợp CK7
và CK20 trong chẩn đoỏn và cho kết quả thấy di căn ung thư biểu mụ tuyến
cú nguồn gốc từ đại tràng cú kiểu hỡnh miễn dịch CK7 -/ CK20 + (100%) [71]. Wang NP và CS (1995) nghiờn cứu 114 trường hợp di căn ung thư
khụng rừ nguồn gốc đến xương, phổi và gan, sử dụng kết hợp CK7 và CK20 trong chẩn đoỏn. Kết quả nghiờn cứu đó tỡm ra cỏc kiểu hỡnh miễn dịch gợi ý
nhiều đến ung thư của đại tràng và phổi [75]. Một nghiờn cứu khỏc của
Kummar và CS (2002) trờn 102 trường hợp ung thư biểu mụ tuyến nguyờn phỏt ở phổi và di căn đến phổi của ung thư biểu mụ tuyến đại tràng cho thấy
ở phổi, kiểu hỡnh CK7-/CK20+ là của ung thư biểu mụ tuyến di căn đến phổi
[74]. Saad RS và CS (2009) đó nghiờn cứu và phõn tớch sự bộc lộ cỏc dấu ấn
CK7, CK20 bằng kỹ thuật nhuộm hoỏ mụ miễn dịch 55 trường hợp ung thư
biểu mụ tuyến đại trực tràng. Kết quả cho thấy 12/55(22%) CK7 cú biểu hiện dương tớnh và 48/55 (87%) CK20 cú biểu hiện dương tớnh. Tỷ lệ CK7-
/CK20+ được xỏc định 36/55 (65%), CK7 +/CK20+ là 12/55(22%) [76]. Shin
JH và CS (2010) đú nghiờn cứu đỏnh giỏ sự biểu hiện của cytokeratin 7 (CK7), cytokeratin 20 (CK20) trong ung thư đại trực tràng cỳ di căn đến
buồng trứng. Tỷ lệ dương tớnh CK7 là 82,9%; CK20 (65,9%)[72]. Trong những nghiờn cứu gần đõy người ta thấy kiểu hỡnh CK(-)/CK19(+)/CDX2(+)
là đặc trưng cao trong ung thư ĐTT[75].
1.5.2.2 MUC-1, MUC-2
Sản phẩm chế tiết của hầu hết cỏc ung thư biểu mụ tuyến đường tiờu húa
(đặc biệt của những ung thư biểu mụ typ ruột) là một chất nhầy acid, dễ dàng
được phỏt hiện bằng mucicarmine Mayer, xanh lơ Alcian hoặc nhuộm sắt keo
dạng và cú đặc điểm giống như của mucin typ ruột [72]. Những thay đổi khỏc
nhau trong sialil húa những chất nhầy này xảy ra và cú thể phỏt hiện được bằng húa mụ hoặc húa mụ miễn dịch . Chất nhầy được chế tiết bởi ung thư biểu mụ typ
lan tỏa và cú trong bào tương tế bào nhẫn là typ acid hoặc trung tớnh, typ trung
tớnh chiếm ưu thế trong một số trường hợp [72].
Ở mức húa mụ miễn dịch, cỏc typ nhầy chớnh bộc lộ (với nhiều biến đổi và trựng lắp là MUC-1 cho typ ruột), MUC-5AC cho typ lan tỏa, MUC-2 cho typ nhầy và MUC-5B cho typ khụng xếp loại [72]. Cũng cú mối liờn quan thỳ vị giữa
typ chất nhầy và vị trớ u, với ý nghĩa là MUC-5AC phổ biến với ung thư biểu mụ
của hang vị trong khi MUC-2 bộc lộ với khối lượng lớn hơn với ung thư biểu mụ
1.5.2.3 CDX-2:
CDX-2 là một gen của homeobox typ đuụi, nú mó hoỏ một yếu tố phiờn mó cú vai trũ quan trọng trong sự tăng sinh và biệt hoỏ của cỏc tế bào biểu mụ
của ruột. Nú được phỏt hiện bằng hoỏ mụ miễn dịch trong đại đa số cỏc ung thư biểu mụ đại trực tràng. CDX-2 cú trong khoảng 90% cỏc trường hợp và HepPar-1 cú trong khoảng 80% cỏc trường hợp. CDX-2 xuất hiện rất sớm trong
sự phỏt triển của u chứng tỏ một sự thay đổi từ kiểu hỡnh dạ dày thành kiểu hỡnh ruột [84],và CDX-2 bộc lộ với tỷ lệ cao trong ung thư ĐTT khoảng 76% [57], [72], [76].
1.5.2.4. Protein p53 Cấu trỳc p53
Ở người gen p53 nằm ở nhỏnh ngắn của nhiễm sắc thể 17 (17p13.1).
Gen p53 cú chiều dài 20kb bao gồm 11 exon giống nhau, đỏnh số từ E1 đến
E11. Khi bị đột biến, gen p53 cú thể mất toàn bộ 2 alen hoặc chỉ 1 alen bị
mất đi (mất tớnh dị hợp tử) trong khi alen kia bị đột biến ở một vài vị trớ,
trường hợp này hay gặp hơn cả. Cỏc đột biến cú thể ở cỏc exon đầu (2-4),
đoạn mó húa vựng C tận cựng, ở cỏc exon cuối (9-11), đoạn mó húa vựng N tận cựng, nhưng đa số là ở cỏc exon giữa (5-8), đoạn mó húa vựng gắn kết
AND (96%) [77], [78].
WTp53: ở chuột và người protein p53 cú từ 390- 393 axit amin, gồm
nhiều vựng cú chức năng khỏc nhau.
MTp53: đột biến gen p53 cú thể gặp ở cỏc dạng: thờm nucleotit, mất
một nucleotit hay thay đổi nucleotit, dạng thường gặp nhất là đột biến thay đổi nucleotit (thường hay thay đổi một nucleotit) dẫn đến sự tạo ra cỏc protein p53 đột biến, mutantp53 (MTp53) [77], [78], [79]. Cỏc vị trớ axit
amin bị thay đổi hay gặp nhất là Arg157, Gly245, Arg248, Arg249, Arg273 và Arg282 [77].
Cỏc nghiờn cứu cho thấy WTp53 được xếp vào nhúm gen ức chế ung thư, trong khi MTp53 khụng chỉ mất khả năng ức chế phỏt triển u mà trong một vài thời điểm nú lại cú chức năng khởi đầu cho sự tăng sinh tế bào.
Chức năng của protein p53
Khi AND của tế bào bị tổn thương sẽ kớch hoạt protein p53. Protein p53 cú
tỏc dụng làm ngừng chu trỡnh phõn bào cho đến khi ADN được sửa chữa hoặc
gõy hiện tượng chết tế bào theo chương trỡnh nếu ADN tổn thương khụng thể
sửa chữa được. Vỡ vậy protein p53 được coi như người canh gỏc bộ gen tế bào (guardian genome). Ngoài ra protein p53 cũn cú khả năng kớch hoạt hay ức
chế một số gen khỏc.
Chức năng của WTp53
Kiểm soỏt chu trỡnh tế bào: chức năng của p53 khỏ khỏc biệt với cỏc
gen u và ức chế u khỏc. Thay vào việc điều hũa chu kỳ tế bào, gen này hỡnh
như kiểm tra và bảo toàn tớnh toàn vẹn của bộ gen. Cỏc tế bào thiếu p53 cú
sự khụng ổn định bộ gen và nhanh chúng mất khả năng duy trỡ số lượng
chớnh xỏc của cỏc nhiễm sắc thể. Gen p53 đỏp ứng với hư hại di truyền
bằng cỏch cản trở tế bào trong cỏc pha G1, S hoặc G2 của chu kỳ tế bào,
ngăn cản nhõn chia trước khi việc sửa chữa cỏc ADN bị hư hại cú thể được
thực hiện. Đồng thời sau khi dũ tỡm tổn thương, p53 cú thể làm cho cỏc tế
bào chết theo chương trỡnh.
Gõy chết tế bào theo chương trỡnh: khi cỏc tổn thương ADN khụng thể
sửa chữa được, p53 gõy cảm ứng chết tế bào theo chương trỡnh theo 2 con
đường: thụng qua tương tỏc của p53 với một số gen và thụng qua tương tỏc
của p53 với một số protein. Kết quả là tế bào đi vào con đường chết theo chương trỡnh và sẽ bị loại bỏ nhờ hiện tượng thực bào [78], [79].
Chức năng của MTp53
Cỏc đột biến của gen ức chế u p53 là một biến đổi di truyền phổ biến
nhất trong cỏc u ở người. MTp53 khụng cú khả năng cảm ứng chết tế bào theo
chương trỡnh. Ngoài ra, bản thõn MTp53 cũn trở thành một gen sinh ung thư
(oncogene) với khả năng tạo u và hoạt húa cỏc gen gõy ung thư khỏc. Một số
gen khởi điểm bỡnh thường bị ức chế bởi WTp53 lại được kớch hoạt bởi dạng
MTp53. Tuy nhiờn, trong một vài trường hợp MTp53 giữ được khả năng ức
chế của gen p53 và điều này cú thể giải thớch sự khỏc nhau trong chuyển dạng
MT và sự nổi trội của một vài p53 trong một số khối u [8], [80].
Bộc lộ protein p53 và liờn quan tiờn lượng ung thư đại trực tràng
Lan và CS (2007) nghiờn cứu làm rừ vai trũ của bộc lộ quỏ mức p53 và
tương quan của nú với cỏc yếu tố lõm sàng bệnh học trong ung thư đại trực
tràng. Sự bộc lộ p53 trong mụ u được đỏnh giỏ bằng phõn tớch hoỏ mụ miễn
dịch sử dụng khỏng thể đơn dũng của chuột đặc hiệu p53 người. Kết quả là
37,6% trường hợp (n=258) cú bộc lộ quỏ mức của p53 trong mụ u. Sự tớch lũy
của p53 trong cỏc mụ u khụng liờn quan với tuổi, giới, mức CEA của huyết
tương trước phẫu thuật, lượng mucin, tỡnh trạng hạch và giai đoạn u. Liờn
quan cú ý nghĩa thống kờ được tỡm thấy giữa sự bộc lộ quỏ mức p53 và vị trớ u
trong trực tràng (p=0,038). Những u biệt hoỏ cao tới vừa cú tỷ lệ bộc lộ quỏ
mức p53 cao hơn cú ý nghĩa so với những u kộm biệt hoỏ (40,0% so với
20,0%, p= 0,05) [79]. Trong một phõn tớch đa biến, tỷ lệ sống thờm đặc hiệu ung thư 3 năm cao hơn cú ý nghĩa ở những bệnh nhõn với u bộc lộ quỏ mức p53 (82,2%) hơn ở những bệnh nhõn khụng cú bộc lộ quỏ mức. Cỏc tỏc giả đó
đi đến kết luận là sự tớch lũy protein p53 cú thể cú giỏ trị tiờn lượng thuận lợi trong ung thư đại trực tràng. Theo y văn mức độ biểu hiện của p53 càng cao thỡ tớnh chất bệnh càng nghiờm trọng. Đõy là một trong những dấu ấn húa mụ
Cỏc phương phỏp phỏt hiện p53
