Phương pháp nhốt
Nhốt trong cấu trúc mạng gel:
Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị biến đổi qua quá trình cố định. Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá các gel khi có mặt đồng thời enzyme. Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp người ta thu được enzyme bị nhốt trong các lỗ gel. Gel đã có enzyme có thể nghiên nhỏ bằng cách đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhở rồi đem sấy ở nhiệt độ thấp. Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1993) thu được bằng cách trùng hợp acrylamine với N, và nN – metylenbisacrylamine. Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp thu được dễ tạo thành hạt và tuỳ vào điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác nhau.
Alginate và carragennan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận lợi để gói enzyme và tế bào. Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzyme, hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt.
Dạng các sợi tổng hợp:
Phương pháp này được thực hiện bằng việc trộn enzyme vào chất mangm tạo dịch lỏng, cho dịch lỏng này chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp ở các màng. Phương pháp này được Dinelli (1972) tiến hành giống như tạo sợi celluloza triacetate trong methylen clorua và enzyme dạng dung dịch trong đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất của nitơ. Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluene, sau đó được làm khô trong chân không.
Enzyme được nhốt trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuyếch tán ra ngoài. Vì ezyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất lớn hơn so với trường hợp nhốt trong cấu trúc dạng gel.
Dạng màng siêu lọc:
Phương pháp này đơn giản tương tự như nhốt trong bao vi thể. Enzyme được giữ trong màng siêu lọc. Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp qua lại tự do, nhưng giữ lại enzyme có trọng lượng phân tử cao.
2.9.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định
Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính chất của enzyme ban đầu (enzyme hoà tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme không hoà tan là:
2.9..5.1 Bản chất và tính chất hoá học của chất mang
Các tính chất lý học của chất mang như tính hoà tan, tính bền cơ học, độ trương, điện tích, tính háo nước và kị nước, .. đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền, và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định. Bản chất hoá học của chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme, và tơi khả năng chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng.
Dẫn xuất enzyme không hào tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme hoà tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế biến tính của enzyme trong dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen và liên kết kỵ nước.
Sự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác.
2.9.5.2 Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố vào các yếu tố
Kích thước lỗ gel của chất polymer. Trọng lượng phân tử của cơ chất.
Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do.
Trong vấn đề này, đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò hàng đầu. Song những hạn chế khuyếch tán không đơn giản như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do.
2.9.5.3 Aûnh hưởng của pH lên enzyme không hào tan
Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme cố định. pH tối ưu của enzyme hoà tan, sự chuyển dịch pH tối ưu là do ảnh hưởng của trường tĩnh điện của chất mang tạo nên.
2.9.6 Ưùng dụng của enzyme cố định
Trong công nghiệp:
Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như: công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hoá chất, …
Rượu bia: các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được sử dụng ở quy mô lớn.
Chế biến sữa: enzyme lactase cố định để thuỷ phân lactose sữa.
Năm 1969, Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định Năm 1971, đã sử dụng chymotrypsin liên kết cộng hoá trị với carboximethyl
Trong y học:
Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học để chữa các bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Do đó, cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ.
Enzyme cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh. Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như: lượng glucose, urea, cholesterol, … enzyme horse radish peroxidase cố định trên polystyrene cùng với kháng thể, giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kỹ thuật ELISA).
Trong nghiên cứu khoa học:
Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiên đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoseoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt có gel polyacrylamide. Nhúng điện cực vào dung dịch có glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuyếch tán vào gel có chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng và nồng độ glucose.
Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử proteinem sử dụng trong phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc hiệu vơi enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng chế phẩm tế bào cố định để xử lý nước thải đạt hiệu quả.
Trong bảo vệ môi trường:
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu bia, chế biến đường, .. chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu hữu cơ. Do đó
có thể sử dụng enzyme cố định để xử lý nước thải sinh học nhằm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra môi trường bên ngoài.
2.9.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thuỷ phân bằng enzymea. Aûnh hưởng nồng độ enzyme a. Aûnh hưởng nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm