Theo Zhu và ctv. (2008), tam bội là tiêu chuẩn quan trọng để chọn lọc cây trồng không hột. Theo Komatsu and Iwamasa (1996), cây tam bội phát triển kém ngay sau khi nẩy mầm, nhƣng sẽ sinh trƣởng mạnh mẽ và tốt hơn thể lƣỡng bội thông thƣờng ở một năm sau. Cây tam bội sẽ cho trái không hột ngay cả khi thụ phấn chéo với giống khác (Jackson và Gmiter, 1997).
Theo Jackson và Gmiter (1997), khi phân bào giảm nhiễm, giao tử phân bào bất bình thƣờng ra tế bào với bộ nhiễm sắc thể tam bội. Theo Raza và ctv. (2003) giống tam bội trên cam quýt có thể đƣợc tạo ra bằng nhiều phƣơng pháp chẳng hạn: thụ phấn chéo giữa cây lƣỡng bội và cây tứ bội, kỹ thuật cứu phôi, sự xuất hiện ngẫu nhiên quần thể tam bội, sự chiếu xạ, nuôi cấy phôi nhũ và công nghệ sinh học hiện đại. Kỹ thuật cứu phôi cũng có thể tạo ra cây tam bội, điều này đƣợc khẳng định bởi Moore và ctv. (2005).
1.8 CẤU TẠO BẦU NOÃN, TIỂU NOÃN, SỰ SẢN SINH TÚI PHÔI 1.8.1 Cấu tạo bầu noãn và tiểu noãn
Theo Jackson và Gmiter (1997) cho rằng trong tiểu noãn, tế bào nguyên bào tử hình thành xung quanh phôi tâm trƣớc khi vỏ phát triển hoàn chỉnh và những tế bào bên ngoài có kích thƣớc lớn và nhân to. Nguyên bào tử phân chia từ 1 tế bào cánh hoa và túi phôi của tế bào mẹ. Tế bào cánh hoa phân chia nhanh và đại bào tử sớm bị bao quanh bởi một tế bào gần trung tâm của phôi tâm. Đại bào tử phải trãi qua sự phân chia giảm nhiễm cho ra 4 tế bào đơn bội với chỉ 1 nhiễm sắc thể trên 1 tế bào. Những tế bào đại bào tử sắp xếp thành một hàng theo chiều dọc trong phôi tâm. Ba trong bốn đại bào tử thoái hóa và còn lại một đại bào tử phát triển và sau đó hình thành túi phôi (Hình 1.1)
Hình 1.1 Sự phát sinh đại bào tử (Jackson và Gmiter 1997) vỏ ngoài
vỏ trong phôi tâm
ba đại bào tử thoái hóa
đại bào tử chức năng Hình 1.1c. Sự phát triển tiểu noãn giai
đoạn hình thành 4 đại bào tử
Hình 1.1d. Sự phát triển tiểu noãn giai đoạn hình thành đại bào tử chức năng vỏ ngoài
phôi tâm bốn đại bào tử
vỏ trong
vỏ trong
Hình 1.1a. Sự phát triển tiểu noãn giai đoạn hình thành nguyên bào tử
Hình 1.1b. Sự phát triển tiểu noãn giai đoạn hình thành đại bào tử phôi tâm vỏ trong vỏ ngoài nguyên bào tử Tế bào tầng nuôi phôi tâm vỏ ngoài đại bào tử
Đại bào tử chức năng phân chia tạo ra 2 nhân con, di chuyển về hai cực của túi phôi và ở lại đó cho đến khi phân chia tiếp theo. Khi đó, tế bào chất giảm bớt để tạo thành một lớp mỏng ở ngoại vi của túi phôi, trừ xung quanh nhân. Hai nhân con tiếp tục phân chia tạo ra bốn nhân hình thành hai cặp ở hai cực của túi phôi. Nhân phân chia tiếp tục tạo ra 8 nhân. Bốn nhân ở cuối lỗ noãn của túi phôi phát triển thành trứng. Bốn nhân ở cuối dây noãn hình thành ba đối cực và nhân cực thấp hơn để hoàn thành quá trình phát triển túi phôi (Hình 1.2).
vỏ ngoài vỏ trong phôi tâm đại bào tử lỗ noãn sự phát triển túi phôi phôi tâm vỏ trong vỏ ngoài lỗ noãn
Hình 1.2a Sự phát triển túi phôi giai đoạn đầu
Hình 1.2b Sự phát triển túi phôi giai đoạn 2 nhân
lỗ noãn phôi tâm vỏ ngoài vỏ trong sự phát triển túi phôi
Hình 1.2d Sự phát triển túi phôi giai đoạn 8 nhân Hình 1.2c Sự phát triển túi phôi
giai đoạn 4 nhân lỗ noãn phôi tâm vỏ ngoài vỏ trong sự phát triển túi phôi
Hình 1.2 Sự phát triển túi phôi (Jackson và Gmiter 1997)
Tiếp theo là sự phát triển của hợp tử. Hợp tử thƣờng phát triển theo một trình tự nhất định. Hợp tử sẽ ƣu tiên phân chia theo chiều dài, sau đó sẽ phân chia theo chiều ngang. Dần dần, phôi sẽ có dạng dùi cui. Phần ngoại biên của phôi trở thành trung tâm phân chia tế bào và phát triển thành dạng khối cầu. Tiếp theo của quá trình phân chia sẽ hình thành các cấu trúc chuyên biệt. Cuối cùng là quá trình phát triển của hạt giống. Nội nhũ sẽ gia tăng kích thƣớc. Nhân phôi có thể phát triển trƣớc khi quá trình phân chia tế bào trứng diễn ra. Túi phôi sẽ dần đƣợc thay thế bằng phôi và phôi nhũ, sau đó túi phôi sẽ đƣợc tiêu hóa. Các cấu trúc khác tiếp tục phát triển và trở nên hoàn thiện hơn (Jackson và Gmitter, 1997 đƣợc trích bởi La Hàng Châu, 2011).
1.8.2 Sự sản sinh túi phôi
Theo Nguyễn Khoa Lân và Ngô Đắc Chứng (2005), chỗ các lớp vỏ noãn tiếp hợp với phôi tâm gọi là hợp điểm, trong phôi tâm chỉ có một tế bào có khả năng phân chia đó là tế bào mẹ bào tử lớn (2n) qua hai lần giảm phân để tạo thành bốn bào tử lớn (n). Chỉ có một bào tử lớn phân chia nguyên nhiễm ba lần, để hình thành túi phôi gồm tám tế bào (noãn bào, nhân thứ cấp, hai trợ cầu).
2 trợ cầu
2 nhân cực
3 đối cực tế bào
trứng
Hình 1.2e: Hình vẽ chi tiết cấu tạo 8 nhân trong túi phôi
tế bào trứng 2 trợ cầu
hợp nhất 2 nhân cực
3 đối cực
Hình 1.2e: Cấu tạo 8 nhân trong túi phôi giai đoạn trƣởng thành
1.9 QUÁ TRÌNH THỤ PHẤN, THỤ TINH VÀ TẠO TRÁI TRÊN CAM QUÝT QUÝT
1.9.1 Quá trình thụ phấn
Thụ phấn là sự vận chuyển của hạt phấn từ bao phấn đến đầu nƣớm nhụy (Ortiz, 2002; Jackson và Futch, 1997). Nƣớm của bầu noãn có một chất nhờn để bắt giữ hạt phấn (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Hạt phấn rơi trên nƣớm nhụy cái, dính vào đó một thời gian dài ngắn khác nhau, có thể nảy mầm ngay hoặc sau vài phút đến vài giờ, vài ngày hay vài tuần lễ tùy theo từng loài khác nhau (Hà Thị Lệ Ánh, 2005).
Theo Nguyễn Bá (1978), sự thụ phấn là khi bao phấn mở và hạt phấn phát tán đi và đƣợc đƣa đến đầu vòi nhị cái theo các cách khác nhau. Ngƣời ta phân biệt hai kiểu thụ phấn là tự thụ và thụ phấn chéo.
- Thụ phấn chéo là hiện tƣợng hạt phấn của hoa này rơi lên đầu nhị của hoa khác hoặc hoa của cây khác. Kiểu thụ phấn này chủ yếu nhờ động vật, côn trùng, nhờ vào gió và nhờ vào nƣớc.
- Tự thụ phấn là hiện tƣợng thụ phấn ở các hoa lƣỡng tính khi hạt phấn từ bao phấn rơi lên nƣớm nhị hoặc bằng cách nào đấy mà hạt phấn thụ phấn cho nƣớm nhị trên cùng một hoa đó.
1.9.2 Quá trình thụ tinh
Sự thụ tinh là quá trình tiếp diễn sau sự thụ phấn, do sự phối hợp giữa giao tử đực và giao tử cái (Hà Thị Lệ Ánh, 2005) hay thụ tinh là sự vƣơn dài của ống phấn đến noãn cầu với sự tạo thành hợp tử. Tiến trình thụ tinh xảy ra bao gồm hai sự kiện hợp nhất: một nhân sinh dục kết hợp với một nhân trứng tạo giao tử và nhân sinh dục khác kết hợp với hai nhân cực tạo thành nội nhũ, sản phẩm cuối cùng của sự thụ tinh kép là hột (Lê Thanh Phong, 2000).
Hạt phấn rơi lên nƣớm nhị nhờ tác nhân nào đó nhƣ côn trùng, gió, nƣớc… hạt phấn dính trên nƣớm thời gian dài ngắn khác nhau, sức sống của hạt phấn cũng cũng có thời gian nhất định. Tại đây hạt phấn sẽ nảy mầm, ống phấn đi xuyên qua mô đƣa đƣờng của vòi đƣa các giao tử đực đến túi phôi để kết hợp với giao tử cái ở đó (Nguyễn Bá, 1978).
Sau khi xảy ra sự thụ phấn hạt phấn bị giữ trên bề mặt của nƣớm nhụy, hạt phấn bắt đầu nảy mầm và tạo ra ống phấn phát triển xuống dƣới bầu noãn và có sự kết hợp với tế bào trứng trong bầu noãn. Sự kết hợp này gọi là sự thụ tinh. Sau khi xảy ra hiện tƣợng thụ tinh, hột phát triển và trái tăng trƣởng (Warmund, 1996 trích bởi Nguyễn Minh Sang, 2010).
1.9.3 Sự tạo trái
Theo Nguyễn Minh Chơn (2010), sự tạo trái có thể định nghĩa nhƣ là sự phát triển nhanh của noãn mà thƣờng theo sau bằng sự thụ phấn và thụ tinh.
Nguyễn Kim Thanh và Châu Ngọc Thuận (2005) đã nhận định rằng hàm lƣợng auxin trong bầu của các loài có hột cao hơn nhiều so với các loài không hột, khi phân tích hàm lƣợng auxin trong bầu noãn của các loài có hột và không có hột.
Bầu noãn cho trái, vách bầu noãn cho các mô vỏ trái, noãn là nguồn gốc của hột, đƣợc tạo ra bởi một nhu mô đồng nhất 2n gọi là phôi tâm. Sự hình thành trái và hột trên cây có hoa và trái thông thƣờng trải qua 4 giai đoạn: thụ phấn, nảy mầm, phát triển của ống phấn và thụ tinh (Bùi Trang Việt, 2000 trích bởi Đoàn Huy Lƣợng, 2011).
1.10 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CAM QUÝT BẰNG PHƢƠNG PHÁP THÁP
Mục đích của ghép là tận dụng ƣu thế của gốc tháp để làm tăng khả năng chống chịu của cây giống. Ƣu điểm của phƣơng pháp tháp so với phƣơng pháp chiết cành thể hiện rất rõ ở khả năng miễn nhiễm bệnh do virus, nấm bệnh Phytophthora. Ngoài ra, tháp còn dễ kiểm soát độ đồng đều và tính sạch bệnh, tận dụng đƣợc ƣu thế gốc tháp. Nhƣng việc tháp thì gốc tháp và thân tháp phải có quan hệ họ hàng với nhau.
Theo Nguyễn Bá (1978), gốc tháp và cành tháp có thể có ảnh hƣởng với nhau theo nhiều cách.
- Trƣớc hết nếu rễ cây của gốc tháp ít có khả năng hấp thu, dự trữ và sử dụng chất dinh dƣỡng thì sẽ dẫn đến việc giảm bớt kích thƣớc và sự phát triển của thân tháp.
- Điều rõ ràng nhất là nƣớc và muối hoà tan đƣợc vận chuyển từ gốc tháp vào cành tháp còn các hydrat cacbon thì lại đƣợc vận chuyển tại chỗ dính nhau về hai hƣớng. Nhƣ vậy, phần này đã gây ra biến đổi nhất định về mặt dinh dƣỡng của phần kia.
Theo IPGRI (1999), sự tƣơng hợp đƣợc đánh giá bằng tỷ lệ đƣờng kính thân tháp/gốc tháp đo tại vị trí trên và dƣới vết tháp 20 cm. Phƣơng pháp tháp ứng dụng nguyên lý là vết thƣơng đƣợc gắn lại khi dòng nhựa giữa hai phần cành tháp và gốc tháp có thể tƣơng hợp với nhau (Mai Văn Quyền và ctv, 2005 trích bởi Đoàn Huy Lƣợng, 2011).Theo Khan và Kender (2007), gốc tháp có ảnh hƣởng lớn đến những đặc điểm quan trọng của chồi tháp, chẳng hạn: kích thƣớc cây, năng suất và chất lƣợng trái. Aubert và Vullin (2001) cho rằng tuỳ theo loại gốc tháp đã sử dụng, phẩm chất trái thu hoạch sẽ thay đổi một cách đáng kể về kích thƣớc trái, độ dày và màu sắc vỏ trái hoặc hàm lƣợng nƣớc, hàm lƣợng đƣờng và acid trong trái. Ngoài ra, đƣờng kính gốc tháp và chồi tháp nên có kích cỡ nhƣ nhau (Williamson và Jackson, 1994). Gốc tháp phải kết hợp tốt với mắt tháp thì mới sinh trƣởng mạnh, tuổi thọ cao, giúp cây tháp cho năng suất cao và phẩm chất trái tốt. Chất lƣợng trái đƣợc xác đinh bởi kiểu gene của cành tháp, không bị kiểu gene của gốc tháp làm giảm đi (Hà Thị Lệ Ánh, 2005).
Cam Mật đƣợc trồng từ lâu ở đồng bằng sông Cửu Long, khả năng thích nghi khá tốt với điều kiện môi trƣờng và chống chịu đƣợc sâu bệnh tốt nên đƣợc trồng phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long, ngay cả trên vùng đất sét nặng xa sông (Nguyễn Bảo Vệ và Lê Thanh Phong, 2004). Trần Thế Tục và Hoàng Ngọc Thuận 2000), cây tháp mắt hay tháp cành thì mang đặc tính di truyền của cây mẹ. Cây tháp sẽ cho trái sớm hơn cây trồng bằng hột. Chính vì vậy, mà gốc cam Mật thƣờng đƣợc tháp với quýt Đƣờng và đƣợc trồng rất phổ biến ở đồng bằng sông Cửu long.
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 PHƢƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: Thí nghiệm đƣợc thực hiện từ tháng 09/2011 đến tháng 10/2012. Địa điểm: Trại Giống Cây ăn trái Vĩnh Long, thành phố Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long. Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm bộ môn Khoa học cây trồng, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Cây giống đƣợc tháp trên gốc tháp cam Mật và mắt tháp đƣợc lấy từ cây quýt Đƣờng không hột mã số 1 (dòng quýt Đƣờng không hột số 1), cây quýt Đƣờng không hột mã số 80 (dòng quýt Đƣờng không hột số 2) và cây quýt Đƣờng có hột mã số 63 (giống quýt Đƣờng có hột) làm đối chứng (Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2007)
2.2 PHƢƠNG PHÁP 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 2.2.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức với 16 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 cây.
Nghiệm thức 1: Dòng quýt Đƣờng không hột số 1. Nghiệm thức 2: Dòng quýt Đƣờng không hột số 2. Nghiệm thức 3: Giống quýt Đƣờng có hột.
2.2.2 Kỹ thuật canh tác
Kỹ thuật canh tác chính theo qui trình trồng, chăm sóc và thu hoạch cây cam quýt ở các tỉnh phía Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2001), đƣợc nêu cụ thể trong tài liệu tiêu chuẩn ngành “Quy trình trồng, chăm sóc và thu hoạch cây có múi ở các tỉnh phía Nam” (10 TCN 481 – 2001).
Chuẩn bị đất và trồng cây
Mô để trồng cây có bề rộng 1 m, chiều cao 0,4 m. Mô đƣợc đắp từ mặt đất có bón phân chuồng (10 kg/mô), phân lân vi sinh (Sông Gianh) (3 kg/mô) và vôi (CaO) (1 kg/mô).
Khoảng cách trồng: cây cách cây 1,7 m; hàng cách hàng 2,5 m.
Mỗi hố trồng đƣợc bón lót 25 g DAP (18 – 46 – 100) ở đáy hố, có lắp đất mặt 10 cm, để tránh rễ tiếp xúc trực tiếp với phân.
Cây đƣợc trồng vào tháng 3/2010 Chăm sóc
Cây đƣợc tƣới đủ ẩm để bảo đảm sinh trƣởng tốt nhất.
Tiến hành cắt tỉa cành, tạo tán cho cây khi cành phát triển quá mức.
Sử dụng phân bón NPK (30-20-10), bón khoảng 50 g/gốc vào thời điểm lá già (khoảng 2 tháng/lần). Có bổ sung dinh dƣỡng bằng các loại phân bón lá vào thời điểm cây còn tơ (lúc cây chƣa ra hoa, kết trái).
Sử dụng luân phiên các loại thuốc trừ sâu nhƣ Nokap, Lannate 40SP, Dragon… và các loại thuốc trừ bệnh nhƣ Zineb, Topsin… vào thời điểm cây ra đọt non để phòng trừ sâu bệnh.
Sử dụng Trichoderma bằng cách tƣới vào gốc (6 tháng/lần).
2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi
2.2.3.1 Chỉ tiêu về sinh trưởng
Các chỉ tiêu sinh trƣởng đƣợc lấy 3 tháng/ lần vào ngày cuối tháng.
- Đƣờng kính gốc tháp (mm): Đo ở vị trí cố định phía dƣới mắt tháp 10 cm. - Đƣờng kính thân tháp (mm): Đo ở vị trí cố định phía trên mắt tháp 10 cm. - Tỷ số đƣờng kính thân tháp/gốc tháp.
- Chiều cao cây (cm): Đo từ mặt đất đến đỉnh chồi cao nhất của cây. - Chiều rộng tán cây (cm): Đo từ hai chóp lá rộng nhất của cây.
2.2.3.2 Đặc tính hình thái thực vật
* Các đặc tính hình thái thực vật
Khảo sát các đặc tính hình thái thực vật về cây, lá, hoa và trái mô tả theo IPGRI (1999) (Phụ chƣơng 1). Cụ thể nhƣ sau:
- Lá: Thu 30 lá/cây, chọn cành ngoài cùng có lá thành thục (già). Thu 2 lá ở vị trí giữa cành và thu ở 15 cành.
- Hoa: Thu 10 hoa/cây, chọn hoa trên ngọn phát hoa (mọc cao nhất trên phát hoa).
- Trái: Thu 10 trái/cây, chọn ngẫu nhiên trái trên cây.
* Chất lƣợng trái
- Trọng lƣợng ăn đƣợc (g) = Trọng lƣợng trái tƣơi – (Trọng lƣợng vỏ + Trọng lƣợng hột chắc + Trọng lƣợng hột lép). - Trọng lƣợng hột (g) = Trọng lƣợng hột lép + Trọng lƣợng hột lép. - Tỷ lệ vỏ/trái (%) = Trọng lƣợng vỏ (g) x100 Trọng lƣợng trái (g) - Tỷ lệ hột/trái (%) = Trọng lƣợng hột (g) x100 Trọng lƣợng trái (g) - Tỷ lệ ăn đƣợc (%) = Trọng lƣợng ăn đƣợc (g) x100 Trọng lƣợng trái (g)
- Độ pH: Dịch trái sau khi ép đƣợc đo bằng pH kế hiệu ORION (USA).
- Độ Brix (%): Dịch trái sau khi ép đƣợc đo bằng khúc xạ kế hiệu ATAGO (Nhật sản xuất).
- Vitamin C (acid ascorbic) dịch trái: Định lƣợng vitamin C theo phƣơng pháp chuẩn độ với 2,6 dichlorophenol indophenol (Nguyễn Minh Chơn và ctv., 2005), cụ thể nhƣ sau:
+ Bƣớc 1: Cân 5 ml dịch trái. + Bƣớc 2:
1 2 ( ) 0, 088 ( / 100 ) a b x V 100 X mg g x V xm
Chuẩn bị mẫu thật: Cho 10 ml HCl 1% và 35 ml acid oxalic 1% vào 5 ml dịch trái. Lọc lấy dịch trong.
Chuẩn bị mẫu blank: Thực hiện tƣơng tự mẫu thật nhƣng thay thế 5 ml