5. Điểm mới của đề tài
3.1.1.Phõn lập chủng nấm men từ dịch nho
Nguyờn liệu dung để sản xuất rƣợu vang ở đõy là quả nho Cabernet
sauvignon. Quả thu về phải đƣợc chọn lấy cỏc quả đó chớn, loại bỏ cỏc quả
cũn non, quả dập nỏt thối rữa. Quả đó đƣợc chọn đem rửa sạch bằng nƣớc rồi để rỏo. Sau đú cho vào bỡnh sạch ngõm đƣờng theo tỉ lệ 1 : 1. Sau khoảng một thỏng ta thu đƣợc dung dịch siro nƣớc quả cú nồng độ đƣờng khoảng 60 – 80% và nhiều dƣỡng chất khỏc từ thịt quả.
Khi dịch nƣớc quả cú hiện tƣợng lờn men tiến hành phõn lập. Ta tiến hành sử dụng phƣơng phỏp phõn lập trờn hộp petri. Mụi trƣờng để tuyển chọn cỏc khuẩn lạc nấm men là mụi trƣờng Hanxen ( MT1). Qua phƣơng phỏp phõn lập trờn hộp petri, tuyển chọn ra một tập hợp cỏc tế bào nấm men của cựng một nũi cú kớch thƣớc, hỡnh thỏi, khả năng lờn men nhƣ nhau.
Cỏch tiến hành: Khử trựng mụi trƣờng phõn lập và phõn vào cỏc hộp
petri vụ trựng để nguội. Chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức, dựng pipet hỳt 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch quả cho vào ống thứ nhất (dịch pha
23
loóng ở 10-1). Sau đú lại hỳt 1ml dịch ở ống thứ nhất vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch cú độ pha loóng 10-2. Làm tƣơng tự với cỏc ống tiếp theo cho đến ống 9 sẽ cú độ pha loang 10-9. Cú thể chọn ở cỏc nồng độ 10-6
– 10-9.
Tiến hành phõn lập nấm men trờn mụi trƣờng thạch đĩa, dựng pipet hỳt 1 – 2 giọt dịch pha loóng nhỏ vào đĩa peptri cú sẵn mụi trƣờng Hanxen đó đƣợc khử trựng. Sau đú dựng que trang dàn đều lờn mặt thạch. Đặt ngƣợc cỏc hộp petri xuống, dựng giấy bỏo gúi lại và nuụi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300C. Sau 2 – 3 ngày lấy ra quan sỏt. Trờn bề mặt thạch ta thấy xuất hiện cỏc khuẩn lạc, dựa vào hỡnh thỏi khuẩn lạc nấm men ta thƣờng chọn những khuẩn lạc to, trũn, lồi, nhẵn búng cú màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men. Kết quả phõn lập chọn ra 3 mẫu nấm men dựng làm đối tƣợng nghiờn cứu tiếp theo.
Hỡnh 3.1. Chủng nấm men phõn lập được trờn mụi trường thạch đĩa
Sau đú cỏc khuẩn lạc này chỳng tụi cấy sang cỏc ống thạch nghiờng đó cú sẵn mụi trƣờng Hanxen vụ trựng để giữ giống, sau 2 – 3 ngày lấy ống thạch nghiờng ra quan sỏt, làm tiờu bản soi kớnh để kiểm tra hỡnh thỏi tế bào nấm men. Kớ hiệu cho cỏc chủng nấm men thu đƣợc là T1, T2, T3.
24
Hỡnh 3.2. Chủng nấm men T1, T2, T3 trờn mụi trường thạch nghiờng 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men cú khả năng lờn men vang nho Cabernet sauvignon
3.1.2.1. Xỏc định hoạt lực lờn men của cỏc mẫu nấm men T1, T2, T3 bằng phương phỏp cõn trọng lượng bỡnh
Cỏch tiến hành : Cỏc mẫu nấm men T1, T2, T3 đƣợc lờn men ở mụi trƣờng lờn men 3 (MT3) trong cỏc bỡnh lờn men cú dung tớch 100ml với hàm lƣợng đƣờng ban đầu là 250(g/l), hàm lƣợng men giống ban đầu 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 – 280C. Sau 48h, đem cõn trọng lƣợng bỡnh ban đầu sau đú mở nắp bỡnh lờn men, tiếp tục đem cõn trọng lƣợng bỡnh thấy trọng lƣợng bỡnh giảm đi. Đú chớnh là lƣợng CO2 sinh ra trong quỏ trỡnh lờn men. Lƣợng CO2
sinh ra càng nhiều thỡ trọng lƣợng bỡnh càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lờn men càng cao. Kết quả thu đƣợc ở bảng sau:
Bảng 3.1. Hoạt lực lờn men của cỏc chủng lờn men (g/100ml) sau 48h
Tờn chủng nấm men Trọng lƣợng bỡnh ban đầu (g) Trọng lƣợng bỡnh sau 48h lờn men (g) Lƣợng CO2 thoỏt ra (g) T1 184,10 178,87 0,19 T2 188,60 188,00 0,6 T3 180,06 178,91 1,15
25
T1 và T2, chứng tỏ chủng T3 cú hoạt lực lờn men mạnh nhất.
3.1.2.2. Nghiờn cứu khả năng lờn men đường
Xỏc định khả năng lờn men đƣờng của cỏc chủng nấm men thu đƣợc chỳng tụi xỏc định HL đƣờng sút và nồng độ cồn trong dung dịch lờn men. Cỏc chủng nấm men đƣợc đƣa vào mụi trƣờng dịch quả 100ml, HL đƣờng 250(g/l), pH: 4, nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu là 3,5 x 10 6
tế bào/ml. kết quả nghiờn cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.2:
Bảng 3.2. Khả năng lờn men của cỏc chủng nấm men trờn mụi trường lờn men
Chỉ tiờu đỏnh giỏ Chủng nấm men
T1 T2 T3
Đƣờng tổng số (g) 250 ± 0,2 250 ± 0,2 250 ± 0,2
HL đƣờng sút (%) 6,1 ± 0,008 5,8 ± 0,008 5,0 ± 0,01
HL cồn (%V) 9,3 ± 0,04 9,8 ± 0,08 10,16 ± 0,08
Qua bảng 3.2, chỳng tụi nhận thấy chủng T3 nấm men cú hàm lƣợng đƣờng sút thấp nhất, hàm lƣợng cồn cao nhất, sau đú là cỏc chủng T1 và T2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.2.3. Khả năng lờn men ở cỏc độ pH khỏc nhau
Để xỏc định khả năng lờn men của cỏc chủng nấm men ở cỏc độ pH khỏc nhau, chỳng tụi tiến hành lờn men ở cỏc bỡnh tam giỏc 100ml, với hàm lƣợng đƣợng là 250(g/l), nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5x106
TB/ml ở pH biến đổi khỏc nhau : 3; 3,5; 4; 4,5; 5. pH đƣợc điểu chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch axit axetic 98% và đo độ pH bằng giấy pH. Xỏc định lƣợng CO2 thoỏt ra sau nuụi cấy, kết quả nghiờn cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.3:
26
Bảng 3.3. Khả năng lờn men ở cỏc độ pH khỏc nhau
Chủng pH
3 3,5 4 4,5 5
T1 + + ++ +++ +
T2 + + ++ +++ ++
T3 + ++ +++ +++ +++
Trong đú: +++ : HL CO2 đƣợc tạo ra trờn 30(g/l) dịch lờn men ++ : HL CO2 đƣợc tạo ra từ 25 – 30(g/l) dịch lờn men + : HL CO2 đƣợc tạo ra trờn 20(g/l) dịch lờn men
Từ kết quả thu đƣợc cho thấy rằng: Cỏc mẫu nấm men đều cú sinh trƣởng và phỏt triển trong khoảng pH từ 4 – 4,5. Ở cỏc khoảng pH cũn lại, cỏc chủng nấm men cú hoạt lực lờn men thấp hơn. Chủng T3 cú hoạt lực lờn men mạnh nhất, sau đú là T2 và T1.
3.1.2.4. Khả năng kết lắng của cỏc chủng nấm men
Hũa tan sinh khối nấm men thu đƣợc vào trong dung dịch đệm axetat rồi lắc trờn mỏy lắc với tốc độ 200 vũng/phỳt thời gian 3 – 5 phỳt và để lắng 15 phỳt. Chỳng tụi thu đƣợc bảng 3.4:
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men
Tờn chủng T1 T2 T3
Chiều cao cột sinh khối(mm) 13 15 19
Theo kết quả ở bảng trờn, chỳng tụi nhận thấy chủng cú khả năng kết lắng tốt nhất là T3, tiếp theo là T2 và T1.
3.1.2.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm
Sau khi lờn men đƣợc 30 ngày, chỳng tụi tiến hành xỏc định khả năng tạo hƣơng thơm bằng phƣơng phỏp cảm quan. Chỳng tụi thu đƣợc kết quả ở bảng 3.5:
27
Bảng 3.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của 3 mẫu nấm men
STT
Chỉ tiờu đỏnh giỏ
Mẫu
T1 T2 T3
1 Độ trong Ít trong Ít trong Trong
2 Hƣơng thơm Ít thơm Thơm Thơm
Kết quả phõn tớch cho thấy, mẫu nấm men T3 đạt hƣơng thơm và độ trong tốt hơn mẫu T1, T2. Tổng hợp kết quả nghiờn cứu của 3 mẫu nẫm men, chỳng tụi nhận thấy mẫu nấm men T3 cú khả năng lờn men tốt nhất và tạo sản phẩm cú nhiều ƣu điểm. Vỡ vậy, chỳng tụi quyết định chọn mẫu nấm men T3 cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.1.2.6. Xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men nghiờn cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chỳng tụi tiến hành xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men ở mẫu T3 chỳng tụi dựa vào đặc tớnh sinh học của nấm men nhƣ :
Khả năng lờn men cỏc loại đƣờng. Khả năng đồng húa muối nitrat.
Khả năng hỡnh thành bào tử kết hợp quan sỏt khuẩn lạc. Quan sỏt hỡnh dạng tế bào trờn kớnh hiển vi.
Sinh sản nảy chồi từ nhiều phớa.
Căn cứ vào khúa phõn loại của Lodder (1970) và cỏc kết quả thớ nghiệm đối với chủng T3 cú đặc tớnh:
1. Tế bào hỡnh trứng, ovan, hỡnh cầu ( hỡnh 3.1) 2. Sinh sản nảy chồi nhiều phớa
28
Hỡnh 3.3. Chủng T3 trờn mụi trường thạch nghiờng
Hỡnh 3.4. Hỡnh thỏi tế bào chủng nấm men T3 (x1000 lần)
Từ đú, căn cứ vào khúa phõn loại của Lodder (1970) và kết quả thớ nghiệm đối với chủng nấm men T3 chỳng tụi xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men phõn lập từ dịch nho Cabernet sauvignon là Saccharomyces cerevisiae T3 (S.cerevisiae T3).
Như vậy, từ dịch siro nho Cabernet sauvignon, chỳng tụi đó phõn lập được 3 chủng và tuyển chọn được 1 chủng nấm men S. cerevisiae cú hoạt lực lờn
29
men tốt và cú khả năng kết lắng tốt. Chọn làm đối tượng nghiờn cứu tiếp theo.
3.2. Nghiờn cứu động thỏi sinh trƣởng và ảnh hƣởng của một số nhõn tố trong quỏ trỡnh nhõn giống của chủng nấm men S. cerevisiae T3 trong quỏ trỡnh nhõn giống của chủng nấm men S. cerevisiae T3
3.2.1. Nghiờn cứu động thỏi sinh trưởng của chủng S. cerevisiae T3 trong quỏ trỡnh nhõn giống
Trong quỏ trỡnh sản xuất rƣợu vang, giai đoạn nhõn giống chiếm một thời gian ngắn 24 – 48h nhƣng lại cú vai trũ hết sức quan trọng trong quỏ trỡnh nhõn nhanh số lƣợng tế bào nấm men. Việc nghiờn cứu động thỏi sinh trƣởng, phỏt triờn của chủng S. cerevisiae T3 là một phần quan trọng trong quỏ trỡnh sản xuất rƣợu vang.
Để xỏc định động thỏi sinh trƣởng của chủng nấm men S. cerevisiae
T3, tiến hành cấy giống vào mụi trƣờng nhõn giống với số lƣợng tế bào ban đầu là 3,5 x 106
tế bào/ml, nuụi lắc 150 vũng/phỳt ở 300C. Sau 6h kiểm tra lại 1 lần. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.6:
Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng của chủng S. cerevisiae T3 trong mụi trường nhõn giống SLTB x 106TB/ML 0 3,5 ± 1,1 6 11 ± 0,1 12 47 ± 1 18 94 ± 0,38 24 120 ± 0,49 30 147 ± 0,5 36 132 ± 0,2 42 81 ± 0,2 48 74 ± 0,2
30
Hỡnh 3.5. Biểu đồ biểu diễn động thỏi sinh trưởng của chủng nấm men
S. cerevisiae T3 ( SLTB x 106) trong mụi trường nhõn giống
Qua hỡnh 3.5 ta thấy, số lƣợng tế bào trong 12h đầu tăng chậm. Lƣợng tế bào này tăng nhanh từ 12h đến 24h. Từ 24h đến 30h số lƣợng tế bào tăng chậm, ổn định và đạt giỏ trị cực đại. Từ 36h đến 48h số lƣợng tế bào bắt đầu giảm. Sở dĩ trong 6h đầu số lƣợng tế bào tăng chậm là do đõy là thời gian nấm men làm quen với mụi trƣờng. Từ 12h đến 24h, nấm men thực hiện quỏ trỡnh trao đổi chất để sinh trƣởng nờn số lƣợng tế bào tăng nhanh. Khi nguồn dinh dƣỡng giảm số lƣợng tế bào cú tăng nhƣng khụng đỏng kể, khụng cú nguồn dinh dƣỡng để sinh trƣởng và sinh sản nờn bị chết dần, đú là thời điểm 30h – 48h. Nhƣ vậy quỏ trỡnh sinh trƣởng của chủng S. cerevisiae T3 cú thể chia thành 4 giai đoạn:
Giai đoạn từ 0h – 12h ứng với pha tiềm phỏt. Giai đoạn từ 12h – 24h ứng với pha logarit. Giai đoạn từ 24h – 30h ứng với pha cõn bằng. Giai đoạn từ 30h – 48h ứng với pha suy vong.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h SL TB x 10 6 Thời gian (h) SLTB
31
Mục đớch nghiờn cứu thớ nghiệm này là để xỏc định thời gian nhõn giống thớch hợp là 24 – 30h và là cơ sở để nghiờn cứu ảnh hƣởng của một số nhõn tố tới quỏ trỡnh sinh trƣởng của chủng nấm men đó đƣợc tuyển chọn
S. cerevisiae T3 phự hợp với một số tỏc giả [12],[13].
3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quỏ trỡnh nhõn giống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự sinh trƣởng và phỏt triển của nấm men phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đú cú nhiệt độ của mụi trƣờng nhõn giống. Để xỏc định đƣợc nhiệt độ thớch hợp cho quỏ trỡnh nhõn giống ta tiến hành cấy chủng S. cerevisiae T3 vào mụi trƣờng nhõn giống, pH: 3,8 – 4,2, với số lƣợng giống ban đầu là 3,5 x 106tb/ml ở cỏc mức nhiệt độ là: 24, 26, 28, 30, 32, 36 (0C). Thu đƣợc kết quả ở bảng 3.7:
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quỏ trỡnh nhõn giống
SLTB x 106tb/ml Nhiệt độ (0 C) 24 26 28 30 32 36 T h ờ i g i a n 0h 3,5 ± 1,1 3,5± 1,1 3,5 ± 1,1 3,5 ± 1,1 3,5 ± 1,1 3,5 ± 1,1 4h 3,8± 0,04 5,8 ± 0,08 6,1 ± 0,04 4,6 ± 1,1 4,5 ± 1,1 5 ± 1,0 8h 9,8 ± 0,08 11,2 ± 0,04 13,6 ± 1,1 10,5±0,08 9,9 ± 0,04 9,5 ± 1,1 12h 12,6±0,04 38 ± 1,0 41 ± 1,2 32 ± 1,0 28,2± 0,08 19,6± 0,08 16h 50,1±0,08 96 ± 1,0 98 ± 1,0 80 ± 1,1 93± 1,1 75 ± 0,04 20h 110 ± 1,0 140 ± 1,0 154 ± 1,1 106 ± 1,1 105±1,1 104 ± 1,1 24h 140 ± 1,1 155 ±1,1 162 ± 1,3 143 ± 1,0 142 ± 1,0 139 ± 1,1 28h 136 ± 1,1 162 ±1,0 164 ± 1,1 139 ±1,1 138 ± 1,1 125 ± 1,1
Sau hai ngày nuụi cấy số lƣợng nấm men đạt giỏ trị cực đại ở cỏc mẫu cú nhiệt độ 26 – 280C. Ở nhiệt độ trờn 300C tốc độ sinh trƣởng của chủng nấm men T3 bị giảm khụng phự hợp cho quỏ trỡnh sản xuất. Vỡ vậy chỳng tụi quyết định
32
giữ nhiệt độ cho quỏ trỡnh lờn men của chủng nấm men T3 ở khoảng 26 – 280
C.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của pepton
Pepton là nguồn nitơ thớch hợp cho sự sinh trƣởng và phỏt triển của nấm men, để xỏc định hàm lƣợng pepton phự hợp với sự phỏt triển của nấm
men S. cerevisiae T3 chỳng tụi tiến hành cấy chủng vào bỡnh 100ml chứa mụi
trƣờng nhõn giống với hàm lƣợng từ 1 – 10 (g/l). Sau 24h thu đƣợc kết quả ở bảng 3.8:
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pepton đến sự sinh trưởng và phỏt triển của
chủng S. cerevisiae T3 (x106tb/ml) sau 24h Hàm lƣợng (g/l) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SLTB x 106 159,3 ± 0,4 243 ± 0,04 423,6 ±0,48 453,6 ±0,08 400,3 ±0,04 340 ±0,04 305,6 ±0,08 213,6 ± 0,08 133,6 ±0,08 106,6 ±0,08
Pepton là nguồn kớch thớch sinh trƣởng của nấm men. Dựa vào bảng 3.8, thấy ở HL pepton 1 – 2 (g/l) thỡ SLTB nấm men thấp159,3 – 243x106 tế bào. Khi HL nitơ trong dịch lờn men thấp, cú thể dẫn đến sự sinh trƣởng của nấm men chậm, kộo dài thời gian lờn men hoặc thời gian lờn men khụng triệt để và số lƣợng cỏc chất chuyển húa giảm chất lƣợng. Ở HL nitơ từ 5 – 10 (g/l) thỡ SLTB nấm men giảm dần từ 400,3 – 106,6x106 tế bào. Ở HL 3 – 4 (g/l) cỏc tế bào nấm men sinh trƣởng và phỏt triển tốt, SLTB tạo ra nhiều. Kết quả này phự hợp với một số tỏc giả [8].
Vỡ vậy, hàm lƣợng pepton từ 3 – 4 (g/l) là phự hợp với chủng nấm men S. cerevisiae T3.
Như vậy, đó xỏc định được động thỏi sinh trưởng và nhiệt độ từ 26 –
33
triển của chủng nấm men S. cerevisiae T3.
3.3. Nghiờn cứu động thỏi lờn men vang nho Cabernet sauvignon của chủng nấm men S. cerevisiae T3 chủng nấm men S. cerevisiae T3
Động thỏi lờn men vang là quỏ trỡnh chuyển húa đƣờng và cỏc chất hữu cơ cú trong dịch quả thành rƣợu, cỏc axit hữu cơ, vitamin và chất thơm… làm cho rƣợu vang cú hƣơng vị đặc trƣng khỏc hẳn nhiều loại rƣợu khỏc.
Để xỏc định động thỏi lờn men vang nho Cabernet sauvignon chỳng tụi tiến hành lờn men trong cỏc bỡnh dung tớch 500ml. Mụi trƣờng lờn men là dịch siro nho Cabernet sauvignon đƣợc pha loóng với nƣớc cất để đạt đƣợc hàm lƣợng đƣờng ban đầu 250(g/l), hàm lƣợng men giống là 10% giống, pH: 4, nhiệt độ 26 – 280C. Tiến hành phõn tớch mẫu 2 ngày 1 lần trong 15 ngày liờn tục. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.9:
Bảng 3.9. Động thỏi của quỏ trỡnh lờn men vang nho Cabernet sauvignon
Thời gian (ngày) HL đƣờng khử (%) HL cồn (%) SLTB x 106 0 25 0 3,5 ± 0,04 2 18,5 ± 0,04 3,8 ± 0,04 23,6 ± 0,08 4 14,8 ± 0,04 4,7 ± 0,04 121,3 ± 0,04 6 13,1 ± 0,08 7,5 ± 0,08 279 ± 0,04 8 10,6 ± 0,08 9,1 ± 0,08 296,6 ± 0,08 10 8,2 ± 0,04 9,3 ± 0,04 261,6 ± 0,08 12 6,5 ± 0,04 9,5 ± 0,04 228 ± 0,04 14 5,5 ± 0,08 9,6 ± 0,08 158 ± 0,04 15 5 ± 0,08 10,2 ± 0,08 132 ± 0,08
34
Hỡnh 3.6. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi của hàm lượng đường và cồn