5. Điểm mới của đề tài
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.4.1. Phương phỏp vi sinh
2.4.1.1. Tạo nguồn giống nấm men để phõn lập và tuyển chọn
Sử dụng nguyờn liệu là quả nho Cabernet sauvignon để lờn men sản xuất rƣợu vang. Quả nho Cabernet sauvignon sau khi thu hoạch về chọn cỏc quả chớn đem rửa sạch, loại bỏ cỏc quả non và quả dập nỏt, để rỏo nƣớc rồi cho vào cỏc bỡnh sạch ngõm dƣờng theo tỉ lệ 1:1. Sau khoảng một thỏng ta thu đƣợc dịch siro nƣớc quả cú nồng độ đƣờng khoảng 60-80% và nhiều dƣỡng chất khỏc chiết ra từ thịt quả, tiến hành vớt xỏc quả ra và lọc lấy nƣớc dịch quả.
2.4.1.2. Phương phỏp phõn lập, tuyển chọn nấm men trờn mụi trường thạch đĩa
Mụi trƣờng sƣ̉ dụng để tuyển chọn cỏc c hủng nấm men là mụi trƣờng Hanxen.
18
Mụi trƣờng phõn lập đƣợc khử trựng và đƣợc phõn bố vào cỏc hộp vụ trựng petri để nguội theo phƣơng phỏp Paster.
Dịch nho Cabernet sauvignon đƣợc pha loóng từ 10-1 - 10-9 bằng nƣớc cất. Dựng pipetman đó vụ trựng nhỏ 1 - 2 giọt huyền phự với độ pha loóng từ 10-6 - 10-8 lờn bề mặt thạch rồi dựng bàn chang vụ trựng chang đều.
Gúi kớn lại và nuụi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 - 300
C trong ba ngày. Sau ba ngày trờn bề mặt thạch sẽ xuất hiện cỏc khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc cú đặc điểm: to, trũn, lồi, màu trắng, nhẵn, búng đặc trƣng cho nấm men.
2.4.1.3. Phương phỏp hoạt húa giống
Trƣớc khi đƣa vào mụi trƣờng lờn men để cú những tế bào to khỏe ta tiến hành hoạt húa giống bằng cỏch nuụi cấy trờn mụi trƣờng thạch nghiờng 28-300C trong 24h. Sau đú cấy dịch nhõn giống trong 24h đƣợc giống cấp 2.
2.4.1.4. Phương phỏp xỏc định hoạt lực lờn men của tế bào nấm men
Để xỏc định hoạt lực lờn men của nấm men so sỏnh giữa cỏc chủng ta dựng phƣơng phỏp sau:
Phƣơng phỏp cõn trọng lƣợng : Dịch lờn men trong cỏc bỡnh cú cựng thể tớch 250ml mụi trƣờng, cựng cú một lƣợng trung bỡnh nấm men của cỏc giống khỏc nhau. Sau 24h lờn men đem cõn trọng lƣợng bỡnh chờnh lệch giữa hai lần là 0,1 thỡ dừng lại [5].
2.4.1.5. Đếm số lượng tế bào nấm men
Phƣơng phỏp xỏc định số lƣợng tế bào bằng buồng đếm Goriaev M = A * 25 * 50 * N
Trong đú : M : số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phự A : độ pha loóng của dịch huyền phự
N : số lƣợng tế bào trung bỡnh cú trong 1 ụ vuụng
2.4.1.6. Quan sỏt hỡnh thỏi tế bào trờn kớnh hiển vi quang học
19
bào từ ống thạch nghiờng, dàn đều lờn lam kớnh cú chứa 1 giọt nƣớc cất rồi cố định tiờu bản trờn ngọn lửa đốn cồn. Sau đú nhỏ 1 – 2 giọt xanh metylen lờn vết bụi, để trong 2 – 3 phỳt rồi rửa bằng nƣớc cất. Làm khụ tiờu bản rồi quan sỏt trờn kớnh hiển vi quang học cú độ phúng đại 1000 lần [10].
2.4.1.7. Phương phỏp xỏc định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xỏc định dựa trờn tốc độ lắng của sinh khối, cỏch tiến hành nhƣ sau:
Hũa sinh khối nấm men vào dung dịch đờm axit ( pH:4,5),đựng trong cỏc bỡnh cú kớch thƣớc bằng nhau với thể tớch dung dịch đệm và số lƣợng nấm men nhƣ nhau. Lắc trờn mỏy với tốc độ 200 vũng/phỳt trong khoảng thời gian từ 3-5 phỳt và để lắng trong vũng 15 phỳt. Đo chiều cao của lớp kết lắng, lớp kết lắng cao nhất thỡ chủng tƣơng ứng cú khả năng kết lắng cao nhất [3].
2.4.1.8. Phương phỏp xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men đó được tuyển
Việc xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men đó tuyển đƣợc xỏc định dựa trờn cỏc đặc tớnh sinh học của chủng nấm men nhƣ sau :
Khả năng lờn men cỏc loại đƣờng
Quan sỏt hỡnh dạng tế bào nấm men trờn kớnh hiển vi Khả năng đồng húa cỏc muối nitrat
Sinh sản nảy chồi nhiều phớa
2.4.2. Phương phỏp húa lớ
2.4.2.1. Xỏc định hàm lượng đường bằng khỳc xạ kế
2.4.2.2. Xỏc định độ cồn bằng alcol kế và phương phỏp húa học 2.4.2.3. Xỏc định độ pH bằng giấy đo pH
2.4.2.4. Xỏc định hàm lượng axit trong dung dịch lờn men:bằng cỏch dựa vào
nguyờn tắc trung hũa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml NaOH 0,1N dựng để chuẩn độ ta suy ra đƣợc hàm lƣợng axit cú trong dung dịch [10].
2.4.3. Phương phỏp phõn tớch cảm quan
20
cuả con ngƣời để tỡm hiểu mụ tả và định lƣợng cỏc tớnh chất cảm quan vốn cú của thực phẩm nhƣ : màu sắc, hỡnh thỏi, mựi vị.
2.4.4. Phương phỏp xử lớ kết quả bằng thống kờ toỏn học
Xử lớ kết quả nghiờn cứu và đỏnh giỏ theo phƣơng phỏp thống kờ toỏn học thụng qua cỏc thụng số sau: Giỏ trị trung bỡnh số học: 1 n i i M M n Trong đú: M : trung bỡnh tổng thể
Mi : giỏ trị của mỗi kết quả thớ nghiệm từ lần 1 đến lõn thứ n n: số lần thớ nghiệm
Độ lệch chuẩn: 1/ 2(X M)i 2
Trong đú: : độ lệch chuẩn
Xi: Giỏ trị của mỗi kết quả thớ nghiệm từ lần 1 đến lần n M : trung bỡnh tổng thể Sai số trung bỡnh: m n Hệ số biến động:CV x100(%) M
Trong đú : CV: Hệ số biến thiờn tổng thể
: Độ lệch chuẩn M : Trung bỡnh tổng thể
2.5. Phạm vi nghiờn cứu
Chủng nấm men S.cerevisiae phõn lập đƣợc từ dịch nho Cabernet
sauvignon.
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài
22
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phõn lập, tuyển chọn và xỏc định tờn của chủng nấm men cú khả năng lờn men vang nho Cabernet sauvignon năng lờn men vang nho Cabernet sauvignon
Nấm men đúng vai trũ quan trọng đối với toàn bộ qui trỡnh sản xuất và chất lƣợng vang. Nấm men sử dụng lờn men rƣợu vang từ dịch nho Cabernet
sauvignon phải đạt cỏc yờu cầu sau:[20]
Lờn men đƣợc ở nồng độ đƣờng và nồng độ axit khỏ cao. Cú hiệu suất lờn men cao.
Cú khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
Tạo đƣợc hƣơng thơm đặc trƣng và khụng cú vị lạ, khụng sinh độc tố. Ổn định lõu dài trong sản xuất.
3.1.1. Phõn lập chủng nấm men từ dịch nho
Nguyờn liệu dung để sản xuất rƣợu vang ở đõy là quả nho Cabernet
sauvignon. Quả thu về phải đƣợc chọn lấy cỏc quả đó chớn, loại bỏ cỏc quả
cũn non, quả dập nỏt thối rữa. Quả đó đƣợc chọn đem rửa sạch bằng nƣớc rồi để rỏo. Sau đú cho vào bỡnh sạch ngõm đƣờng theo tỉ lệ 1 : 1. Sau khoảng một thỏng ta thu đƣợc dung dịch siro nƣớc quả cú nồng độ đƣờng khoảng 60 – 80% và nhiều dƣỡng chất khỏc từ thịt quả.
Khi dịch nƣớc quả cú hiện tƣợng lờn men tiến hành phõn lập. Ta tiến hành sử dụng phƣơng phỏp phõn lập trờn hộp petri. Mụi trƣờng để tuyển chọn cỏc khuẩn lạc nấm men là mụi trƣờng Hanxen ( MT1). Qua phƣơng phỏp phõn lập trờn hộp petri, tuyển chọn ra một tập hợp cỏc tế bào nấm men của cựng một nũi cú kớch thƣớc, hỡnh thỏi, khả năng lờn men nhƣ nhau.
Cỏch tiến hành: Khử trựng mụi trƣờng phõn lập và phõn vào cỏc hộp
petri vụ trựng để nguội. Chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức, dựng pipet hỳt 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch quả cho vào ống thứ nhất (dịch pha
23
loóng ở 10-1). Sau đú lại hỳt 1ml dịch ở ống thứ nhất vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch cú độ pha loóng 10-2. Làm tƣơng tự với cỏc ống tiếp theo cho đến ống 9 sẽ cú độ pha loang 10-9. Cú thể chọn ở cỏc nồng độ 10-6
– 10-9.
Tiến hành phõn lập nấm men trờn mụi trƣờng thạch đĩa, dựng pipet hỳt 1 – 2 giọt dịch pha loóng nhỏ vào đĩa peptri cú sẵn mụi trƣờng Hanxen đó đƣợc khử trựng. Sau đú dựng que trang dàn đều lờn mặt thạch. Đặt ngƣợc cỏc hộp petri xuống, dựng giấy bỏo gúi lại và nuụi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300C. Sau 2 – 3 ngày lấy ra quan sỏt. Trờn bề mặt thạch ta thấy xuất hiện cỏc khuẩn lạc, dựa vào hỡnh thỏi khuẩn lạc nấm men ta thƣờng chọn những khuẩn lạc to, trũn, lồi, nhẵn búng cú màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men. Kết quả phõn lập chọn ra 3 mẫu nấm men dựng làm đối tƣợng nghiờn cứu tiếp theo.
Hỡnh 3.1. Chủng nấm men phõn lập được trờn mụi trường thạch đĩa
Sau đú cỏc khuẩn lạc này chỳng tụi cấy sang cỏc ống thạch nghiờng đó cú sẵn mụi trƣờng Hanxen vụ trựng để giữ giống, sau 2 – 3 ngày lấy ống thạch nghiờng ra quan sỏt, làm tiờu bản soi kớnh để kiểm tra hỡnh thỏi tế bào nấm men. Kớ hiệu cho cỏc chủng nấm men thu đƣợc là T1, T2, T3.
24
Hỡnh 3.2. Chủng nấm men T1, T2, T3 trờn mụi trường thạch nghiờng 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men cú khả năng lờn men vang nho Cabernet sauvignon
3.1.2.1. Xỏc định hoạt lực lờn men của cỏc mẫu nấm men T1, T2, T3 bằng phương phỏp cõn trọng lượng bỡnh
Cỏch tiến hành : Cỏc mẫu nấm men T1, T2, T3 đƣợc lờn men ở mụi trƣờng lờn men 3 (MT3) trong cỏc bỡnh lờn men cú dung tớch 100ml với hàm lƣợng đƣờng ban đầu là 250(g/l), hàm lƣợng men giống ban đầu 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 – 280C. Sau 48h, đem cõn trọng lƣợng bỡnh ban đầu sau đú mở nắp bỡnh lờn men, tiếp tục đem cõn trọng lƣợng bỡnh thấy trọng lƣợng bỡnh giảm đi. Đú chớnh là lƣợng CO2 sinh ra trong quỏ trỡnh lờn men. Lƣợng CO2
sinh ra càng nhiều thỡ trọng lƣợng bỡnh càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lờn men càng cao. Kết quả thu đƣợc ở bảng sau:
Bảng 3.1. Hoạt lực lờn men của cỏc chủng lờn men (g/100ml) sau 48h
Tờn chủng nấm men Trọng lƣợng bỡnh ban đầu (g) Trọng lƣợng bỡnh sau 48h lờn men (g) Lƣợng CO2 thoỏt ra (g) T1 184,10 178,87 0,19 T2 188,60 188,00 0,6 T3 180,06 178,91 1,15
25
T1 và T2, chứng tỏ chủng T3 cú hoạt lực lờn men mạnh nhất.
3.1.2.2. Nghiờn cứu khả năng lờn men đường
Xỏc định khả năng lờn men đƣờng của cỏc chủng nấm men thu đƣợc chỳng tụi xỏc định HL đƣờng sút và nồng độ cồn trong dung dịch lờn men. Cỏc chủng nấm men đƣợc đƣa vào mụi trƣờng dịch quả 100ml, HL đƣờng 250(g/l), pH: 4, nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu là 3,5 x 10 6
tế bào/ml. kết quả nghiờn cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.2:
Bảng 3.2. Khả năng lờn men của cỏc chủng nấm men trờn mụi trường lờn men
Chỉ tiờu đỏnh giỏ Chủng nấm men
T1 T2 T3
Đƣờng tổng số (g) 250 ± 0,2 250 ± 0,2 250 ± 0,2
HL đƣờng sút (%) 6,1 ± 0,008 5,8 ± 0,008 5,0 ± 0,01
HL cồn (%V) 9,3 ± 0,04 9,8 ± 0,08 10,16 ± 0,08
Qua bảng 3.2, chỳng tụi nhận thấy chủng T3 nấm men cú hàm lƣợng đƣờng sút thấp nhất, hàm lƣợng cồn cao nhất, sau đú là cỏc chủng T1 và T2.
3.1.2.3. Khả năng lờn men ở cỏc độ pH khỏc nhau
Để xỏc định khả năng lờn men của cỏc chủng nấm men ở cỏc độ pH khỏc nhau, chỳng tụi tiến hành lờn men ở cỏc bỡnh tam giỏc 100ml, với hàm lƣợng đƣợng là 250(g/l), nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5x106
TB/ml ở pH biến đổi khỏc nhau : 3; 3,5; 4; 4,5; 5. pH đƣợc điểu chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch axit axetic 98% và đo độ pH bằng giấy pH. Xỏc định lƣợng CO2 thoỏt ra sau nuụi cấy, kết quả nghiờn cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.3:
26
Bảng 3.3. Khả năng lờn men ở cỏc độ pH khỏc nhau
Chủng pH
3 3,5 4 4,5 5
T1 + + ++ +++ +
T2 + + ++ +++ ++
T3 + ++ +++ +++ +++
Trong đú: +++ : HL CO2 đƣợc tạo ra trờn 30(g/l) dịch lờn men ++ : HL CO2 đƣợc tạo ra từ 25 – 30(g/l) dịch lờn men + : HL CO2 đƣợc tạo ra trờn 20(g/l) dịch lờn men
Từ kết quả thu đƣợc cho thấy rằng: Cỏc mẫu nấm men đều cú sinh trƣởng và phỏt triển trong khoảng pH từ 4 – 4,5. Ở cỏc khoảng pH cũn lại, cỏc chủng nấm men cú hoạt lực lờn men thấp hơn. Chủng T3 cú hoạt lực lờn men mạnh nhất, sau đú là T2 và T1.
3.1.2.4. Khả năng kết lắng của cỏc chủng nấm men
Hũa tan sinh khối nấm men thu đƣợc vào trong dung dịch đệm axetat rồi lắc trờn mỏy lắc với tốc độ 200 vũng/phỳt thời gian 3 – 5 phỳt và để lắng 15 phỳt. Chỳng tụi thu đƣợc bảng 3.4:
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men
Tờn chủng T1 T2 T3
Chiều cao cột sinh khối(mm) 13 15 19
Theo kết quả ở bảng trờn, chỳng tụi nhận thấy chủng cú khả năng kết lắng tốt nhất là T3, tiếp theo là T2 và T1.
3.1.2.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm
Sau khi lờn men đƣợc 30 ngày, chỳng tụi tiến hành xỏc định khả năng tạo hƣơng thơm bằng phƣơng phỏp cảm quan. Chỳng tụi thu đƣợc kết quả ở bảng 3.5:
27
Bảng 3.5. Khả năng tạo hương thơm và độ trong sản phẩm của 3 mẫu nấm men
STT
Chỉ tiờu đỏnh giỏ
Mẫu
T1 T2 T3
1 Độ trong Ít trong Ít trong Trong
2 Hƣơng thơm Ít thơm Thơm Thơm
Kết quả phõn tớch cho thấy, mẫu nấm men T3 đạt hƣơng thơm và độ trong tốt hơn mẫu T1, T2. Tổng hợp kết quả nghiờn cứu của 3 mẫu nẫm men, chỳng tụi nhận thấy mẫu nấm men T3 cú khả năng lờn men tốt nhất và tạo sản phẩm cú nhiều ƣu điểm. Vỡ vậy, chỳng tụi quyết định chọn mẫu nấm men T3 cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.1.2.6. Xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men nghiờn cứu
Chỳng tụi tiến hành xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men ở mẫu T3 chỳng tụi dựa vào đặc tớnh sinh học của nấm men nhƣ :
Khả năng lờn men cỏc loại đƣờng. Khả năng đồng húa muối nitrat.
Khả năng hỡnh thành bào tử kết hợp quan sỏt khuẩn lạc. Quan sỏt hỡnh dạng tế bào trờn kớnh hiển vi.
Sinh sản nảy chồi từ nhiều phớa.
Căn cứ vào khúa phõn loại của Lodder (1970) và cỏc kết quả thớ nghiệm đối với chủng T3 cú đặc tớnh:
1. Tế bào hỡnh trứng, ovan, hỡnh cầu ( hỡnh 3.1) 2. Sinh sản nảy chồi nhiều phớa
28
Hỡnh 3.3. Chủng T3 trờn mụi trường thạch nghiờng
Hỡnh 3.4. Hỡnh thỏi tế bào chủng nấm men T3 (x1000 lần)
Từ đú, căn cứ vào khúa phõn loại của Lodder (1970) và kết quả thớ nghiệm đối với chủng nấm men T3 chỳng tụi xỏc định tờn khoa học của chủng nấm men phõn lập từ dịch nho Cabernet sauvignon là Saccharomyces cerevisiae T3 (S.cerevisiae T3).
Như vậy, từ dịch siro nho Cabernet sauvignon, chỳng tụi đó phõn lập được 3 chủng và tuyển chọn được 1 chủng nấm men S. cerevisiae cú hoạt lực lờn
29
men tốt và cú khả năng kết lắng tốt. Chọn làm đối tượng nghiờn cứu tiếp theo.
3.2. Nghiờn cứu động thỏi sinh trƣởng và ảnh hƣởng của một số nhõn tố trong quỏ trỡnh nhõn giống của chủng nấm men S. cerevisiae T3 trong quỏ trỡnh nhõn giống của chủng nấm men S. cerevisiae T3
3.2.1. Nghiờn cứu động thỏi sinh trưởng của chủng S. cerevisiae T3 trong quỏ trỡnh nhõn giống
Trong quỏ trỡnh sản xuất rƣợu vang, giai đoạn nhõn giống chiếm một thời gian ngắn 24 – 48h nhƣng lại cú vai trũ hết sức quan trọng trong quỏ trỡnh nhõn nhanh số lƣợng tế bào nấm men. Việc nghiờn cứu động thỏi sinh trƣởng, phỏt triờn của chủng S. cerevisiae T3 là một phần quan trọng trong quỏ trỡnh sản xuất rƣợu vang.
Để xỏc định động thỏi sinh trƣởng của chủng nấm men S. cerevisiae
T3, tiến hành cấy giống vào mụi trƣờng nhõn giống với số lƣợng tế bào ban đầu là 3,5 x 106
tế bào/ml, nuụi lắc 150 vũng/phỳt ở 300C. Sau 6h kiểm tra lại 1 lần. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.6:
Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng của chủng S. cerevisiae T3 trong mụi