3.3.1 Cách lấy mẫu
Mẫu phân được kiểm tra phải mới, lấy ở từng cụm dọc theo dãy chuồng, lấy bao quát khắp chuồng, đảm bảo tính ngẫu nhiên. Thu thập khoảng 30g mỗi mẫu cho vào túi nilon cột lại và ghi ký hiệu riêng cho từng cụm (địa điểm, lứa tuổi, ngày tháng lấy mẫu), mẫu vừa lấy xong được bảo quản trong thùng có đá khô mang về phòng thí nghiệm Bệnh ký sinh trùng, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ để tiến hành kiểm tra.
Mẫu phân được bảo quản ở nhiệt độ 5-100C và tiến hành kiểm tra trong vòng 2-3 ngày.
20
3.3.2 Phương pháp kiểm tra phân tìm noãn nang của Willis
Nguyên lý của phương pháp này là lợi dụng tỷ trọng của dung dịch lớn hơn tỷ trọng của noãn nang làm cho noãn nang nổi lên.
Mục đích của phương pháp phù nổi là đánh giá tình hình nhiễm cầu trùng. Cách thực hiện: lấy khoảng 3-5 gram phân cho vào lọ nhỏ và cho dung dịch nước muối bão hòa đến 2/3 lọ, dùng que khuấy đều (mỗi mẫu dùng một que riêng để tránh noãn nang từ mẫu này sang mẫu khác). Để yên khoảng một phút sau đó lọc qua rây lược cỡ 81 lỗ/cm2 để loại bỏ phân rác cho dung dịch được sạch.
Tiếp tục cho nước muối bão hòa vào lọ bằng ống nhỏ giọt cho đến khi đầy lọ. Dùng lá kính đặt lên lọ từ từ để không có bọt khí, để yên khoảng 30-35 phút. Dùng kẹp gắp nhẹ lá kính đặt lên phiến kính và quan sát dưới kính hiển vi quang học để tìm noãn nang cầu trùng.
Tỷ lệ nhiễm (%)= (Số mẫu nhiễm/Số mẫu kiểm tra)*100
3.3.3 Phương pháp Mc Master
Mục đích của phương pháp này nhằm xác định cường độ nhiễm cầu trùng, số lượng noãn nang trong một gram phân.
Cách tiến hành: cho vào ống nghiệm có vạch độ 42ml dung dịch NaCl bão hòa. Tiếp tục cho phân vào tới vạch 45ml. Cho vào đó 20 viên bi sắt và lắc đều cho tan phân. Dùng pipet hút 0,15ml dung dịch nhỏ vào 2 buồng đếm, để yên 5 phút rồi đếm số noãn nang nổi rõ lên mặt. Đếm noãn nang trên 2 buồng đếm rồi lấy trung bình.
Số noãn nang trên buồng đếm 1+ số noãn nang trên buồng đếm 2 N=
2 Cách tính:
Thể tích mỗi buồng đếm là 0,15ml
0,15ml của 3 gram phân trong dung dịch 45ml Số noãn nang trung bình của hai buồng đếm là N Số noãn nang trong tổng số 45ml =
15 , 0 45 * N
Vậy số noãn nang có trong một gram phân X=
3 * 15 , 0 45 * N = N*100
Cường độ nhiễm: sau khi tính số noãn nang có trong một gram phân, chúng tôi chia thành các mức độ nhiễm sau:
Cường độ nhiễm 1(+): số lượng từ 50-5000 noãn nang/1 gram phân Cường độ nhiễm 2(+): số lượng > 5000-10000 noãn nang/1 gram phân Cường độ nhiễm 3(+): số lượng >10000 noãn nang/1 gram phân
21
3.3.4 Phương pháp nuôi cấy noãn nang
Theo sự phát triển của noãn nang cầu trùng trong môi trường Bichromate Kali 2,5% xác định thời gian sinh bào tử để bổ sung cho nghiên cứu định danh loài cầu trùng ký sinh trên heo.
Các bước tiến hành: mẫu phân sau khi kiểm tra và xác nhận cường độ nhiễm cao cho vào cốc nhựa lấy 3 gram phân cho vào 50ml nước cất, dùng que khuấy đều, lược qua rây, bỏ cặn. Dung dịch sau khi lược cho vào ống nghiệm đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút, trong 5 phút. Lấy ra đổ bỏ phần nước trong chỉ giữ lại phần cặn trong ống nghiệm, ở trong cặn này mật độ noãn nang rất cao. Cho vào đĩa Petri phần cặn của ống nghiệm và dung dịch Bichromate Kali 2,5% theo tỷ lệ 1:1 (một phần dung dịch chứa noãn nang, một phần dung dịch Bichromate Kali 2,5%) để yên ở nhiệt độ phòng. Mỗi ngày kiểm tra sự phát triển và hình thành bào tử của noãn nang, theo dõi thời gian hình thành bào tử của noãn nang, thời gian sinh bào tử của các loại cầu trùng từ ngày 2 đến ngày thứ 13.
3.3.5 Phương pháp đo kích thước noãn nang
Thước dùng để đo được gắn trong kính hiển vi để đo chiều dài và chiều rộng của từng loại noãn nang cầu trùng. Sau khi đo, kích thước của chiều dài và chiều rộng = số vạch đo * 2,5.
3.3.6 Phương pháp theo dõi thời gian sinh bào tử
Cứ mỗi 2 giờ theo dõi một lần, thời gian sinh bào tử được tính từ lúc noãn nang ra môi trường bên ngoài đến lúc ½ số noãn nang trong vi trường quan sát ở vật kính X10 sinh bào tử.
3.3.7 Phương pháp định danh phân loại
Tiến hành định danh phân loại theo khóa phân loại của Eckert (1995) dựa vào đặc điểm như sau:
Đặc điểm hình thái cấu tạo: đặc điểm vỏ, màu sắc của noãn nang, hình dạng của noãn nang được thực hiện qua phương pháp phù nổi (Willis) và được xem qua kính hiển vi X10 và X40.
Thời gian hình thành bào tử: sau khi mẫu phân nhiễm noãn nang cầu trùng đã được nuôi cấy, cứ 2 giờ kiểm tra một lần để xác định được thời gian hình thành bào tử của từng loài cầu trùng, sau đó so sánh với thời gian hình thành bào tử giữa lí thuyết và thực tế đã đo được để bổ sung cho công tác định danh phân loại.
22
3.3.8 Phương pháp phân tích thống kê
Tất cả các số liệu quan sát được ghi nhận và đánh giá theo phương pháp thống kê sinh học, so sánh tỷ lệ nhiễm bằng phép thử Chi-Square trong chương trình Minitab 15.
23
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 TÌNH HÌNH NHIỄM CẦU TRÙNG HEO TRÊN 2 XÃ CẨM SƠN VÀ PHƯỚC HIỆP HUYỆN MỎ CÀY NAM TỈNH BẾN TRE PHƯỚC HIỆP HUYỆN MỎ CÀY NAM TỈNH BẾN TRE
Bảng 3 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng trên heo tại hai xã Cẩm Sơn và Phước Hiệp trong huyện Mỏ Cày Nam Xã SM KT SM N TLN (%) Cường độ nhiễm 1(+) 2(++) 3(+++) SMN TLN (%) SMN TLN (%) SMN TLN (%) Cẩm Sơn 180 85 47,22 84 98,82 1 1,18 Phước Hiệp 137 83 60,58 75 90,36 2 2,41 6 7,23 Tổng 317 168 53,00 159 94,64 2 1,19 7 4,17
Ghi chú: SMKT: số mẫu kiểm tra SMN: số mẫu nhiễm TLN: tỷ lệ nhiễm
Qua khảo sát 2 địa điểm thuộc huyện Mỏ Cày Nam gồm: xã Cẩm Sơn và xã Phước Hiệp với tổng số mẫu khảo sát là 317 mẫu, kết quả thu được thể hiện qua bảng 3 cho thấy tỷ lệ nhiễm cầu trùng heo tại huyện Mỏ Cày Nam là 53,00%, trong đó xã Phước Hiệp nhiễm cao hơn xã Cẩm Sơn (60,58% và 47,22%).
Về cường độ nhiễm: hầu hết heo trong huyện nhiễm cầu trùng ở mức 1(+) chiếm tỷ lệ 94,64%, tỷ lệ này biến động trong khoảng 90,36-98,82%, cường độ nhiễm 2(++) thấp hơn với tỷ lệ 1,19%, ở cường độ cao 3(+++) cũng được phát hiện ở 2 xã với tỷ lệ thấp 4,17% (1,18-7,23%).
4.2 TÌNH HÌNH NHIỄM CẦU TRÙNG HEO THEO PHƯƠNG THỨC CHĂN NUÔI NUÔI
Bảng 4 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng trên heo theo phương thức chăn nuôi
Hình thức nuôi
Tình hình nhiễm chung Nhiễm theo xã
Cẩm Sơn Phước Hiệp
SMKT SMN TLN (%) SMKT SMN TLN (%) SMKT SMN TLN (%) Gia đình 224 129 57,59a 87 46 52,87 137 83 60,58 Trại 93 39 41,94b 93 39 41,94 Tổng 317 168 53,00 180 85 47,22 137 83 60,58
Ghi chú: SMKT: số mẫu kiểm tra SMN: số mãu nhiễm TLN: tỷ lệ nhiễm
a,b: 2 chữ cái trên cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
Qua bảng 4 nhận thấy ở huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre heo nuôi theo phương thức gia đình (57,59%) nhiễm cầu trùng với tỷ lệ chung cao hơn nhiều so với nuôi theo phương thức trang trại (41,94%).
24
Hình 6 Hệ thống thoát chất thải của chuồng trại nuôi gia đình chưa hợp lý
Nguyên nhân của sự khác biệt này là do phần lớn heo nuôi ở gia đình đều tận dụng khu diện tích quanh nhà, xây dựng chuồng trại chưa hợp lý, khâu vệ sinh chưa được quan tâm đúng mức, chuồng trại ẩm thấp, nguồn nước, thức ăn không đản bảo chất lượng, hệ thống thoát nước và chất thải còn thô sơ, do đó chất thải còn được giữ lại bên trong và xung quanh chuồng nuôi tạo điều kiện cho các mầm bệnh lưu trữ và phát triển, trong đó có mầm bệnh cầu trùng. Trong khi đó, heo nuôi ở trại có tốt hơn như chuồng trại được xây dựng có hệ thống thoát chất thải ra khỏi khu vực nuôi, một số trại chăn nuôi quy mô lớn có thực hiện tiêu độc sát trùng chuồng trại theo định kỳ, có hệ thống nhà sát trùng, do đó đã góp phần hạn chế sự tồn đọng của noãn nang cầu trùng nơi chuồng nuôi.
Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2005), heo nuôi ở tình trạng vệ sinh thú y kém nhiễm cầu trùng cao (55,45% - 66,30%). Tỷ lệ và cường độ nhiễm giảm rõ rệt ở nhiều đàn heo nuôi trong tình trạng vệ sinh tốt.
Hình 5 Chuồng trại tận dụng diện tích quanh nhà
Hình 7 Trại chăn nuôi có phòng sát trùng
Hình 8 Phân heo trong trại chăn nuôi được tập trung để xử lý
25
4.3 TÌNH HÌNH NHIỄM CẦU TRÙNG TRÊN HEO GIỮA CÁC KIỂU CHUỒNG NUÔI CHUỒNG NUÔI
Bảng 5 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng trên trên heo giữa các kiểu chuồng
Kiểu chuồng Tình hình nhiễm chung
Nhiễm theo xã
Cẩm Sơn Phước Hiệp
SMKT SMN TLN (%) SMKT SMN TLN (%) SMKT SMN TLN (%) Nền xi măng 302 159 52,65 180 85 47,22 122 74 60,66 Nền sàn 15 9 60,00 15 9 60,00
Ghi chú: SMKT: số mẫu kiểm tra SMN: số mẫu nhiễm TLN: tỷ lệ nhiễm
Qua bảng 5 cho thấy tỷ lệ nhiễm cầu trùng chung ở chuồng nuôi kiểu nền sàn (60,00%) cao hơn chuồng nuôi kiểu nền xi măng (52,65%). Khi so sánh giữa tỷ lệ nhiễm của 2 loại kiểu chuồng tại xã Phước Hiệp, cho thấy tỷ lệ nhiễm cầu trùng giữa 2 kiểu chuồng không có sự sai khác (60,0% và 60,66%). Do đó, kiểu nền chuồng không ảnh hưởng đến tình hình nhiễm cầu trùng heo tại 2 xã Cẩm Sơn và Phước Hiệp, huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre trong điều kiện nghiên cứu của chúng tôi.
4.4 TÌNH HÌNH NHIỄM CẦU TRÙNG HEO GIỮA CÁC LỨA TUỔI Bảng 6 Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm cầu trùng trên heo giữa các lứa tuổi Bảng 6 Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm cầu trùng trên heo giữa các lứa tuổi
Lứa tuổi Nhiễm chung
Cường độ nhiễm 1(+) 2(++) 3(+++) SM KT SMN TLN (%) SMN TLN (%) SMN TLN (%) SMN TLN (%) Theo mẹ 40 17 42,50 17 100,00 Cai sữa 122 66 54,10 58 87,88 2 3,03 6 9,09 Thịt 97 54 55,67 54 100,00 Nái 58 31 52,54 30 96,77 1 3,23 Tổng 317 168 53,00 159 94,64 2 1,19 7 4,17
Ghi chú: SMKT: số mẫu kiểm tra SMN: số mẫu nhiễm TLN: tỷ lệ nhiễm
Khảo sát heo ở 4 lứa tuổi, bảng 6 cho thấy heo ở 4 lứa tuổi đều nhiễm cầu trùng với tỷ lệ khá cao tuần tự ở heo thịt nhiễm cầu trùng chiếm tỷ lệ cao nhất (55,67%), kế đến là heo cai sữa (54,10%), ở heo nái chiếm tỷ lệ thấp (52,54%) và thấp nhất là heo con theo mẹ (42,50%). Phân tích thống kê cho thấy không có sự sai khác giữa các lứa tuổi. Điều này được giải thích như sau: heo nái sinh sản được chăm sóc tốt, được nuôi trong môi trường có vệ sinh, do đó heo ở lứa tuổi này có sức đề kháng và sự tiếp xúc với mầm bệnh là rất hạn chế, dẫn đến tỷ lệ nhiễm thấp, do đó, heo con được sinh ra từ những heo mẹ này có khả năng nhiễm
26
bệnh là rất thấp. Song song đó, những heo nái nuôi con có tỷ lệ nhiễm thấp thì khả năng heo con theo mẹ bị nhiễm cầu trùng cũng rất ít. Hơn thế nữa, heo con theo mẹ được phòng ngừa bệnh cầu trùng từ lúc 3 ngày tuổi. Vì vậy, heo con theo mẹ nhiễm cầu trùng với tỷ lệ thấp nhất.
Khi ghép bầy, những heo con mang mầm bệnh cầu trùng sẽ lây cho heo khỏe chung bầy dẫn đến tỷ lệ nhiễm cầu trùng ở heo cai sữa có cao hơn so với heo con theo mẹ. Riêng đối với heo thịt do có sức chống đỡ cao với cầu trùng nên không nhiễm ở cường độ cao, không có biểu hiện triệu chứng, từ đó công tác tẩy trừ ở heo thịt không được chú trọng, do vậy mà tỷ lệ nhiễm ở heo thịt cao. Theo Kolapxki N.A. (1980), những gia súc trưởng thành có sức chống đỡ với cầu trùng mạnh hơn những gia súc non. Miễn dịch theo tuổi đuợc hình thành ở gia súc do chúng bị tái nhiễm nhiều lần trong quá trình sinh trưởng.
Kết quả trên cũng phù hợp với những nghiên cứu trước đây cho rằng lứa tuổi sau giai đoạn theo mẹ heo đã được tiếp xúc với thức ăn, nước uống, lại có tập tính lục lọi tìm kiếm tự do trên nền chuồng nên dễ dàng nhiễm mầm bệnh (Lâm Thị Thu Hương và ctv, 2004).
Về cường độ nhiễm, bảng 6 cho thấy ở 4 lứa tuổi heo nhiễm mức độ 1(+) là chủ yếu. Ở heo cai sữa nhiễm cả 3 mức độ 1(+), 2(++) và 3(+++) và ở heo nái sinh sản nhiễm 2 mức độ 1(+) và 3(+++). Điều này giải thích cho việc khi thu thập mẫu, chúng tôi thường thấy ở heo cai sữa có biểu hiện triệu chứng tiêu chảy với phân từ sệt đến lỏng, màu vàng kem đến vàng sậm, đôi khi xám. Kết quả này phù hợp với Nguyễn Thị Kim Lan và ctv (2005), cho biết ở trạng thái phân lỏng, heo nhiễm cầu trùng ở cường độ nặng và rất nặng.
Hình 9Heo nái được nuôi trong môi trường vệ sinh
Hình 10 Phân của heo nái được quét dọn thường xuyên
27
4.5 THÀNH PHẦN LOÀI CẦU TRÙNG KÝ SINH
4.5.1 Kết quả khảo sát hình dạng, kích thước và theo dõi thời gian sinh bào tử bào tử
Bảng 7 Kết quả khảo sát hình dạng, kích thước noãn nang cầu trùng heo
Ký hiệu
loài
Hình dạng
Chiều dài (µm) Chiều rộng (µm) Trung bình dài rộng (µm) Lý thyết Xmin-Xmax (X ) Thực tế Xmin-Xmax (X ± SD) Lý thyết Xmin-Xmax (X ) Thực tế Xmin-Xmax (X ± SD) Esp1 Hình bầu dục hay
tròn, màu vàng sáng, vỏ mỏng 17-25 20,6 18,8-23,8 20,2±1,2 16-22 18,1 15-21,3 18,3±0,6 20,2x18,3
Esp2 Hình elip hay trứng, bề mặt thô dày, có lỗ noãn và nắp noãn 24-42 31,9 23,8-38,8 31,1±1,2 20-24 22,5 20-23,8 21,8±1,2 31,1x21,8
Esp3 Hình elip, màu nâu, không có lỗ và nắp noãn 15-23 18,2 16,3-21,3 18,4±1,1 12-18 14 12,5-15 13,9±0,8 18,4x13,9 Esp4 Hình trứng, vỏ trơn nhẵn, không có lỗ noãn và nắp noãn 15-25 20,4 15-25 20,1±2,6 11-18 14,3 10-17,5 14,1±1,7 20,1x14,1
Esp5 Hình elip hay trứng, màu nâu vàng, không có lỗ và nắp noãn 20-33 29,5 13,8-32,5 28,2±3,7 14-22 18,1 13,8-21,3 17,2±1,8 28,2x17,2
Esp6 Hình bầu dục hay tròn, bề mặt vỏ xù xì 12-15 13,3 11,3-17,5 14,1±1,1 10-13 11,7 10-13,8 12±0,7 14,1x12
Bảng 8 Thời gian sinh bào tử noãn nang cầu trùng heo
Ký hiệu loài Thời gian sinh bào tử (giờ) Lý thuyết Thực tế Esp1 24-48 25 Esp2 216-288 220 Esp3 120-144 127 Esp4 120-168 145 Esp5 192-216 197 Esp6 240-288 243
28
Qua bảng 7 và bảng 8, sau khi quan sát hình dạng, xác định thời gian hình thành bào tử và đo kích thước của từng loại noãn nang trên các mẫu phân nhiễm cầu trùng tại 2 địa điểm thuộc huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre so sánh với lý thuyết, chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác. Dựa vào khóa định danh phân loại noãn nang cầu trùng của Eckert (1995), chúng tôi xác định được heo ở huyện Mỏ Cày Nam tỉnh Bến Tre nhiễm 6 loài cầu trùng thuộc 2 giống Isospora và Eimeria tương ứng với các ký hiệu sau:
Esp1: Isospora suis Esp2: Eimeria scabra Esp3: Eimeria suis Esp4: Eimeria debliecki Esp5: Eimeria polita Esp6: Eimeria perminuta
Hình 11 Isospora suis trước và sau khi sinh bào tử (X40)
Hình 12 Eimeria scabra trước và sau khi sinh bào tử (X40)
29
Hình 14 Eimeria debliecki trước và sau khi sinh bào tử (X40)
Hình 15 Eimeria polita trước và sau khi sinh bào tử (X40)
30
4.5.2 Tình hình nhiễm các loài cầu trùng heo giữa các lứa tuổi Bảng 9 Tỷ lệ nhiễm các loại cầu trùng trên heo giữa các lứa tuổi Bảng 9 Tỷ lệ nhiễm các loại cầu trùng trên heo giữa các lứa tuổi