Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ khảo sát qua các dung dịch chuẩn glycoside đƣợc pha từ các dung dịch chuẩn gốc 1000ppm (trình bày ở bảng 2.1). Các dung dịch đƣợc pha với nồng độ 10, 20, 50, 100, 150, 200, 300, 400 ppm (định mức bằng dung dịch pha động ở điều kiện tối ƣu) cho mỗi glycoside tim. Mỗi dung dịch đƣợc bơm 1 lần trên hệ sắc kí, kết quả đƣợc biểu diễn trên hình 3.7:
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 0 50 100 150 200 250 300 350 Digoxin Digitoxin Diện tích pic Nồng độ chất, ppm Digoxin Độ hấp thụ, mAu
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 0 100 200 300 400 500
Hình 3.7: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của mỗi glycoside tim
Qua kết quả trên ta thấy, đối với mỗi một glycoside tim có sự phụ thuộc diện tích pic và nồng độ là khác nhau. Cụ thể, với digoxin diện tích pic tỉ lệ tuyến tính với nồng độ chỉ tới nồng độ khoảng 150pm, khi nồng độ lớn hơn, diện tích pic không còn tuyến tính nữa. Còn với digitoxin diện tích pic tỉ lệ tuyến tính vào nồng độ trong khoảng nồng độ rộng hơn (khoảng hơn 200ppm), Lớn hơn nồng độ này, diện tích pic không còn tuyến tính nữa.
3.2.2. Dựng đường chuẩn
Chúng tôi dựa vào kết qủa khảo sát sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ trong mục 3.2.1 để tiến hành dựng đƣờng chuẩn của các glycoside. Các dung dịch đƣờng chuẩn 100 ppm, 70ppm, 50ppm đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm, các dung dịch chuẩn từ 5ppm đến 30 ppm đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm. Tất cả các dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng sử dụng pipetman, định mức 10ml bằng dung môi pha động ở điều kiện tối ƣu.
Sau đây là bảng các dung dịch đƣờng chuẩn:
Nồng độ chất, ppm Diện
tích pic
Bảng 3.7: Các dung dịch đường chuẩn
C (ppm) DD1 DD2 DD3 DD4 DD5 DD6 DD7
Digoxin 5 10 20 30 50 70 100
Digitoxin 5 10 20 30 50 70 100
Mỗi dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc bơm trên hệ sắc ký 3 lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc là số liệu để dựng đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu được của các glycoside tim
STT 1 2 3 4 5 6 7
Digoxin 103278 202614 403091 613457 1035322 1397073 2020239
Digitoxin 90288 180347 361395 565455 898430 1237266 1809730
Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim thể hiện ở hình 3.8:
0 20 40 60 80 100 0 500000 1000000 1500000 2000000 D ie n t ich pi c C (ppm) Digoxin: Y = A + B * X
Parameter Value Error
--- A 4880.60534 8278.26228 B 22143.54303 159.63228 --- R SD N P --- 0.99984 10565.38955 7 <0.0001
0 20 40 60 80 100 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 1600000 1800000 2000000 D ie n t ich p ic C (ppm) Digitoxin: Y = A + B * X Parameter Value Error
--- A 4246.67211 9513.32871 B 21940.99753 183.44844 --- R SD N P --- 0.99974 10589.26324 7 <0.0001
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim nghiên cứu trong luận văn
Phƣơng trình hồi qui đƣờng chuẩn của digoxin và digitoxin trong khoảng nồng độ khảo sát 5 đến 100 ppm đều có hệ số tƣơng quan lớn là 0,99984 và 0,99974; chứng tỏ có mối quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic của digoxin và digitoxxin với nồng độ chất phân tích. Phƣơng trình hồi qui này đƣợc sử dụng để tính toán nồng độ chất phân tích trong dịch chiết từ mẫu thông qua tỷ lệ diện tích pic tƣơng ứng, qua đó sẽ tính toán đƣợc hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu.
3.2.3 . Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
LOD, LOQ của thiết bị đƣợc xác định nhƣ mục 2.4.3.
Kết quả đƣợc biểu diễn ở bảng sau:
Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các Glycoside tim
Các glycoside tim LOD (ppm) LOQ (ppm)
Digoxin 1,43 4,76
Digitoxin 1,45 4,82
Qua thực nghiệm, và sau quá trình tính toán giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp:
Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Các glycoside tim Digoxin (ppm) Digitoxin (ppm)
Lần 1 24,90 24.52 Lần 2 24,11 24.07 Lần 3 24,50 25.01 Lần 4 25,00 24,90 Lần 5 25,30 24,22 Lần 6 24,10 25,40 TB 24,71 24,69 S 0,50 0,51 LOD 1,49 1,52 MDL(mg/kg) 99,33 101,33 MQL(mg/kg) 330,7 337,44
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
Mẫu đƣợc xử lí theo quy trình đã nêu trong phần 2.3.1 – phần thực nghiệm. Mẫu đƣợc phân tích trên máy HPLC – PDA trong điều kiện tối ƣu. Sau đó đánh giá phƣơng pháp phân tích dựa trên những kết quả đo đƣợc.
3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích
Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích đƣợc thực hiện bằng cách cân cùng một lƣợng 0,15 gam mẫu (tƣơng ứng với khối lƣợng của 1 viên thuốc), mẫu đƣợc chọn ở đây là mẫu thuốc Digoxine nativelle 0,25mg (mẫu 2). Mẫu đƣợc cân và cho vào ống thuỷ tinh 20ml và tiến hành xử lí theo quy trình đã trình bày ở mục 2.3.1. Chúng tôi tiến hành làm 3 mẫu (3 lần xử lí mẫu nhƣ nhau, với lƣợng cân nhƣ nhau). Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi chỉ phát hiện đƣợc digoxin có trong mẫu thuốc này, còn digitoxin không phát hiện thấy. Nồng độ digoxin của 3 mẫu sau khi tính trung bình của 3 lần đo tƣơng ứng là: C1 = 25,0ppm, C2 = 24,5ppm, C3 = 24,9ppm. Hàm lƣợng chất phân tích có trong viên thuốc đƣợc tính theo công thức:
Digoxin, digitoxin(mg/viên) = C(mg/l).10 (ml) Trong đó:
- C (mg/l) là nồng độ chất phân tích đƣợc suy ra từ đƣờng chuẩn - 10 (ml) là thể tích dung dịch mẫu phân tích
Kết quả độ lặp lại đƣợc thể hiện ở bảng 3.12
Bảng 3.11: Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích
Các glycoside tim Lần 1 (mg/viên) Lần 2 (mg/viên) Lần 3 (mg/viên) %RSD Digoxin 0,25 0,25 0,25 1,07% Digitoxin KPH KPH KPH -- KHP: không phát hiện
Ta thấy %RSD < 5%, nhƣ vậy giữa các lần sử lý mẫu có sự lặp lại khá tốt, điều đó cho thấy phƣơng pháp xử lý mẫu có độ lặp lại đáng tin cậy.
3.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp
Hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phá mẫu là một trong những đại lƣợng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phƣơng pháp. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp sử lý mẫu đã chọn.
Để đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi đã lựa chọn một loại mẫu không phát hiện các glycoside tim, thêm chuẩn vào mẫu đó và xử lý tƣơng tự nhƣ mẫu thực. Mẫu đƣợc chọn là mẫu thuốc paracetamol.
Mẫu đƣợc cân với khối lƣợng 0,15 gam trên cân phân tích, chuyển vào ống thuỷ tinh 20 ml và xử lý theo quy trình đã trình bày ở mục 2.3.1. Nồng độ các glycoside tim thêm vào đƣợc tính theo sau khi định mức.
Bình 3 và 4: mẫu và lƣợng glycoside tim thêm chuẩn mức 1 (25ppm) Bình 5 và 6: mẫu và lƣợng glycoside tim thêm chuẩn mức 2 (50ppm) Hiệu suất thu hồi của các glycoside tim đƣợc xác định theo công thức:
100% x 0 C C C H sp ike b la n k Trong đó:
Cspike: nồng độ thực tế thu đƣợc của mẫu thêm chuẩn sau khi phân tích (ppm) Cblank: nồng độ của mẫu nền (ppm)
C0: nồng độ ban đầu khi thêm chuẩn (ppm) Kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi của các glycoside tim
Các glycoside
tim Cblank (ppm) C0 (ppm) Cspike (ppm) H %
Digoxin 0 25 24,91 99,6%
0 50 52,70 105,5%
Digitoxin
0 25 24,52 98,1%
0 50 48,03 96,1%
Kết quả hiệu suất thu hồi của các glycoside tim khá cao, từ 96,1% đến 105,5%. Vì vậy có thể kết luận phƣơng pháp xử lý mẫu này đáng tin cậy.
3.4. Phân tích mẫu thực tế
Chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thực trên máy HPLC – PDA trong điều kiện tối ƣu.
Mẫu thuốc:
Với mỗi mẫu thuốc, chúng tôi cân một lƣợng tƣơng ứng với một viên 0,15 gam với mẫu 2, 3 và 0,1 gam với mẫu 1(quy trình mục 2.3.1). Mỗi mẫu làm 3 lần, mỗi lần đo trên hệ HPLC 3 lần lấy kết quả trung bình. Hàm lƣợng chất phân tích trong một viên thuốc tính theo công thức:
Digoxin, digitoxin(mg/viên) = C(mg/l).10 (ml) Trong đó:
- C (mg/l) là nồng độ chất phân tích
- 10 (ml) là thể tích dung dịch mẫu phân tích
Dƣới đây là kết quả thu đƣợc của mẫu thực:
Mẫu 1: Chỉ phát hiện thấy digoxin với nồng độ tƣơng ứng với 3 lần tiến hành là: 24,8ppm, 24,4ppp, 24,7ppm. Kết quả phân tích cũng cho thấy không phát hiện (KPH) thấy digitoxin có trong mẫu thuốc. Kết quả tính theo hàm lƣợng chất/viên trong bảng sau:
Bảng 3.13: Kết quả thu được của mẫu 1
Các glycoside tim Lần 1
(mg/viên)
Lần 2 (mg/viên)
Lần 3
(mg/viên) Hàm lƣợng công bố (mg/viên thuốc)
Digoxin 0,25 0,24 0,25 0,25
Digitoxin KPH KPH KPH --
Mẫu 2: Chỉ phát hiện thấy digoxin với nồng độ tƣơng ứng với 3 lần tiến hành là: 25ppm, 24,5ppp, 24,9ppm. Kết quả tính theo hàm lƣợng chất/viên thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.14: Kết quả thu được của mẫu 2
Các glycoside tim Lần 1
(mg/viên) (mg/viên) Lần 2 (mg/viên) Lần 3 Hàm lƣợng công bố (mg/viên thuốc)
Digoxin 0,25 0,25 0,25 0,25
Digitoxin KPH KPH KPH --
Mẫu 3: Cũng chỉ phát hiện thấy digoxin với nồng độ tƣơng ứng với 3 lần tiến hành là: 24,1ppm, 24,3ppp, 24,6ppm
Các glycoside tim Lần 1 (mg/viên)
Lần 2 (mg/viên)
Lần 3
(mg/viên) Hàm lƣợng công bố (mg/viên thuốc)
Digoxin 0,24 0,24 0,25 0,25
Digitoxin KPH KPH KPH --
Nhƣ vậy, dựa vào bảng 3.14, 3.15, 3,16 ta nhận thấy: Chỉ có digoxin trong thuốc, không phát hiện thấy digitoxin. Nhƣ vậy kết quả phân tích tƣơng đối phù hợp với thực tế.
Mẫu dƣợc liệu:
Chúng tôi cũng tiến hành làm 3 mẫu (theo quy trình mục 2.3.1), mỗi mẫu đo 3 lần trên hệ HPLC. Qua kết quả thực nghiệm chúng tôi thấy: không phát hiện thấy digoxin và digitoxin có trong mẫu lá trúc đào.
Dƣới đây là sắc đồ của các mẫu thuốc thật. Mẫu 1: 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 mAU(x10) 225nm,4nm (1.00) 2.5 11 2.8 18 3.1 05 3.6 81 4.1 91 4.4 37 4.6 92 Mẫu 2: 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 mAU(x10) 225nm,4nm (1.00) 2.5 15 2.6 13 2.8 27 3.1 11 3.678 4.2 03 4.4 37 4.7 02 mAu mAu Thời gian, phút Digoxin Digoxin
Mẫu 3: 0.0 2.5 5.0 min 0.0 1.0 2.0 3.0 mAU(x10) 225nm,4nm (1.00) 2.5 25 2.6 24 2.8 18 3.1 16 3.6 79 4.1 86 4.7 07 6.6 63
Hình 3.9: Sắc đồ của mẫu thực – mẫu thuốc
mAu
Thời gian, phút Digoxin
KẾT LUẬN
Qua quá trình làm nghiên cứu phƣơng pháp định lƣợng glycoside tim trong dƣợc phẩm, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
1. Đã tối ƣu hóa đƣợc các điều kiện xác định 02 glycoside tim, điều kiện tách 02 glycoside tim bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng detector PDA. Các điều kiện tối ƣu bao gồm:
Hệ dung môi pha động là ACN/H2O với tỉ lệ ACN/H2O = 55/45
Tốc độ dòng là u = 0,7ml/phút.
Đánh giá đƣợc độ lặp lại của thiết bị phân tích và kết luận hệ máy đã chọn có độ lặp lại tốt, dƣới 5%.
2. Chúng tôi cũng đánh giá đƣợc độ đúng của phƣơng pháp phân tích:
Độ lặp lại của phƣơng pháp xử lý mẫu 1,07 %< 5%
Đánh giá đƣợc độ thu hồi của phƣơng pháp từ 96,1% đến 105,5%.
Ứng dụng phƣơng pháp trên để phân tích một số mẫu thuốc trên thị trƣờng.
3. Dựa trên những điều kiện tối ƣu đã khảo sát, đã áp dụng các điều điều kiện đó để xây dựng đƣờng chuẩn các glycoside tim. Và ứng dụng đƣờng chuẩn này để phân tích các glycoside tim có trong một số mẫu thuốc, mẫu dƣợc liệu.
4.Phân tích đƣợc một số mẫu thuốc điều trị tim lƣu hành trên thị trƣờng, cụ thể mẫu Digoxin- richter, Digoxine nativelle và DigoxineQualy 0,25mg. Kết quả cho thấy các mẫu thuốc này có chứa digoxin với hàm lƣợng tƣơng ứng 0,2463mg/viên, 0,2480mg/viên và 0,2433mg/viên. Nhƣ vậy kết quả phân tích tƣơng đối phù hợp với thực tế. Phân tích mẫu dƣợc liệu là lá trúc anh đào không phát hiện thấy digoxin và digitoxin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Bộ y tế (2010), Dược điển Việt Nam, NXB y học, Hà Nội.
2. Bộ y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB y học, Hà Nội.
3. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
4. Lê Đức Ngọc (2011), Bài giảng nhập môn xử lý số liệu và kế hoạch hoá thực nghiệm, Hà Nội.
5. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phƣơng pháp phổ ứng dụng trong hóa
học, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
6. Nguyễn Văn Ri (2006), Chuyên đề các phương pháp tách chất, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
7. Nguyễn Văn Ri (2013), Các phương pháp tách, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Hà Nội.
8. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng thống kê trong hoá phân tích, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Hà Nội.
9. Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng dược liệu tập 1, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội.
Tiếng Anh:
10. A. Jedlicka, T. Grafnetterova´, V. Miller (2003), “HPLC method with UV detection for evaluation of digoxin tablet dissolution in acidic medium after solid-phase extraction”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,33, pp. 109 – 115.
11. Belachew Desta, E. Kwong and K. M. Mcerlane (1981), “ Sepration of digoxin, digitoxin and their potential metabolites, impurities or
degradation products by High – performance liquid choramatography”,
Journal of Chromatography, 240, pp. 137-143.
12. Federica Pellati, Renato Bruni, Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti (2009), “Optimization and validation of a high- performance liquid chromatography method for the analysis of cardiac glycosides in Digitalis lanata”, Journal of Chromatography A, 1216, pp. 3260–3269.
13. Ferenc Orosz, Mimi Nuridsa’ny and Judid Ova’di (1986), “Isolation and
Quantitative Determination of Some Cardioactive Glycosides from Digitalis lanata by High-Performance Liquid Chromatography”, Analytical biochemistry, 156, pp. 171 – 175.
14. F. Erni and R W. Frei (1976), “A Comoarision of reversed – phase and partiion High performance liquid chromatography of some digitalis glycoside”, Journal of Chromarography, 130 , pp. 169-180.
15. Kevin L. Kelly, Bruce A. Kimball, John J. Johnston (1995), Quantitation of digitoxin, digoxin, and their metabolites by high-performance liquid chromatography using pulsed amperometric detection”, Journal of Chromatography A, 711, pp. 289-295.
16. L.K. Hearn, P.P. Subedi (2009), “ Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy”, Journal of Food Composition and Analysis, 22, pp. 165–168.
17. Ralf Dieter Josephs, Adeline Daireaux, Steven Westwood, Robert Ian Wielgosz (2010), “Simultaneous determination of various cardiac