2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ưu
Các điều kiện tối ƣu trên máy sử dụng cũng nhƣ quá trình sử lí mẫu đã đƣợc khảo sát
Đầu tiên là khảo sát thành phần dung môi pha động đối với từng glycoside tim, và đối với hỗn hợp glycosde tim. Đối với digoxin các tỉ lệ của 2 dung môi ACN/H2O đƣợc lựa chọn để khảo sát từ 40/60 đến 55/45, với digitoxin tỉ lệ pha động ACN/H2O đƣợc khảo sát từ 40/60 đến 70/30, còn với hỗn hợp glycoside tim tỉ lệ này đƣợc khảo sát từ 45/55 đến 60/40. Sau khi lựa chọn đƣợc tỉ lệ pha động chúng tôi tiếp tục khảo sát tốc độ dòng pha động, tốc độ dòng đƣợc chọn để khảo sát từ 0,5 – 1ml/phút.
2.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Để phù hợp với thiết bị sắc kí lỏng HPLC – PDA, cùng với hàm lƣợng glycoside trong một viên thuốc là 0,25 mg (sau này chúng tôi phá mẫu và định mức 10ml), chúng tôi xây dựng các đƣờng chuẩn của các glycoside với nồng độ từ 5ppm đến 100ppm.
Thông tin về các đƣờng chuẩn của các glycoside đƣợc trình bày trong phần kết quả.
2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
- Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Tức là: yL = yb + k.Sb Với yb
là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (lớn hơn 20 thí nghiệm). Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn.
1 1 nb bj b j b y y n nb i b bi b b x x n S 1 2 2 ) ( 1 1 Nhƣ vậy : . b L b k S y y b
Mẫu trắng đƣợc pha với nồng độ chất phân tích xb = 0.
Do đó giới hạn phát hiện: . b k S LOD b
Trong trƣờng hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yb = a. Khi đó tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD = a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k = 3. Sau đó dùng phƣơng trình hồi quy có thể tìm đƣợc LOD.
- Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
YQ = yb+ K. Sb
Thông thƣờng LOQ đƣợc tính với K = 10 tức là CQ = 10.SB/b. Hay S/N = 10 nên suy ra LOQ = 3,33 LOD.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp:
Giới hạn phát hiện (Method detection limit-MDL) và giới hạn định lƣợng (Method quantity limit-MQL) của phƣơng pháp phân tích đối với digoxin và digitoxin không chỉ phụ thuộc vào LOD, LOQ của thiết bị phân tích mà còn chịu ảnh hƣởng bởi qui trình phân tích và tay nghề của ngƣời phân tích. Với giả thiết quá trình làm sạch mẫu đã loại bỏ đƣợc các chất gây ảnh hƣởng, tín hiệu nền thấp và ổn định thì công thức tính MDL dựa trên LOD nhƣ sau:
MDL = LOD.V
m
Trong đó: -MDL: giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp đối với chất phân tích (mg/kg mẫu khô).
-LOD: giới hạn phát hiện của thiết bị đối với chất phân tích (ppm hay mg/l).
-V: thể tích dịch chiết (ml).
-m: khối lƣợng mẫu phân tích (g mẫu khô).
Để xác định MDL của phƣơng pháp chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên một mẫu thuốc chứa digoxin, digitoxin (lƣợng mẫu cân 0,15 gam) và tiến hành xử lý mẫu nhƣ mục 2.3.1, tiến hành làm lặp 6 lần (từ khâu cân mẫu). Do chƣa tìm đƣợc mẫu thuốc nào có chứa digitoxin, nên chúng tôi tiến hành thêm digitoxin chuẩn vào mẫu sao cho lƣợng digitoxin trong dung dịch chiết khoảng 25ppm. Tiến hành làm lặp 6 lần.Giới hạn phát hiện LOD của phƣơng pháp đƣợc tính theo công thức: LOD = 3s, trong đó s: độ lệch chuẩn. Giới hạn định lƣợng LOQ của phƣơng pháp = 3,33LOD.
2.4.4. Đánh giá phương pháp phân tích
Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính chính xác, đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại. Trong nghiên cứu của chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị dựa trên độ lặp lại diện tích pic và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn các glycoside đã đƣợc chọn. Mẫu đƣợc bơm vào hệ 5 lần sau đó lấy diện tích và thời gian lƣu trung bình của các lần và tính đƣợc giá trị %RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp lại cần khảo sát.
Sau khi có đủ điều kiện tối ƣu, chúng tôi tiến hành dựng đƣờng chuẩn 02 glycoside đã khảo sát và thu đƣợc 02 phƣơng trình đƣờng chuẩn.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lí mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Cùng một mẫu thực đƣợc cân với khối lƣợng giống nhau, xử lí cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau quá trình sử lí đƣợc bơm 3 lần để thu đựơc hàm lƣợng trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp sử lí mẫu.
Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp sử lí mẫu. Mẫu đƣợc thêm một lƣợng nhất định các glycoside chuẩn vào ở 2 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng chất sau khi xử lý không bị vƣợt qua đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký
3.1.1. Van bơm mẫu
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lí cơ bản là mẫu ban đầu đƣợc nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xilanh ở áp suất thƣờng, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp vào trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lƣợng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi đựơc lƣợng mẫu bơm vào vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần mở rộng chân pic sắc ký –làm cho pic doãng. Nếu nhƣ vòng mẫu quá dài, lựơng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng pic xảy ra càng lớn, gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách. Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng rất lớn
Lƣợng mẫu đƣợc xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu>Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng đƣợc nữa, pic sẽ doãng, tù và không sắc nét nữa. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng [3,6,7].
Hiện nay, van bơm mẫu sáu chiều rất phổ biến, do đó chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích vòng bơm mẫu là 20l.
3.1.2. Cột tách
Với sắc ký HPLC thì cột tách hay pha tĩnh có vai trò rất quan trọng, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình. Bản chất pha tĩnh quyết định đến cơ chế tách và khả năng lƣu giữ của chất tan. Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích mà chọn
pha tĩnh cho phù hợp. Kích thƣớc hạt nhồi, chiều dài cột phải phù hợp với quá trình tách và xác định chất [7].
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn cột pha đảo RP-HPLC để phân tích, trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách C18 inertsil ODS-3 (250mm × 2,1mm × 5µm) để phân tích, tách và định lƣợng các glycoside. Nhiệt độ cột 300
C.
3.1.3. Detector
Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp, thông thƣờng để theo dõi chất phân tích có hai cách: loại theo dõi tính chất của pha động và loại theo dõi tính chất của chất phân tích từ trong pha động chảy ra một cách liên tục. Trên thực tế cũng cần lƣu ý là sự theo dõi không hoàn toàn là tính chất pha động hay chất tan mà là cả hai, với mức độ khác nhau. Các loại detector thông dụng là UV-VIS, huỳnh quang, điện hoá và độ dẫn. Trên thực tế, hầu hết các chất phân tích đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV-VIS, do đó detector UV-VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu và hầu hết các thiết bị sắc kí lỏng đƣợc trang bị loại detector này. Một kỹ thuật mới phát triển gần đây trong detector UV-VIS sử dụng diode array, chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS[3,6,7]. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện và phân tích chất phân tích.
3.1.4. Bước sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim
Hai chất glycoside tim đƣợc nghiên cứu trong bản luận văn này là digoxin và digitoxin. Cả hai chất này có bƣớc hấp thụ quang cực đại giống nhau là đều ở 220nm. Dải phổ hấp thụ của các glycoside tim này đƣợc quét trên detector PDA từ 190 nm đến 370 nm. Hình 3.1 là phổ UV của 02 glycoside:
Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim
Trong nghiên cứu này chúng tôi thấy rằng, tín hiệu pic của chất phân tích ở bƣớc sóng 220 nm và 225 nm có diện tích pic tƣơng đuơng nhau, nhƣng trong quá trình đo chúng tôi thấy tín hiệu đo ở bƣớc sóng 225 nm ổn định hơn, và ảnh hƣởng của nền lại ít hơn (ít pic nền hơn, diện tích píc nền bé hơn so với ở bƣớc sóng 220), vì vậy chúng tôi chọn bƣớc sóng hấp thụ quang của các glycoside tim là 225 nm trong các phép đo mẫu.
1.1.5. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng.
Pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc kí:
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thời gian lƣu giữ của chất tan - Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef)
- Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh - Độ rộng của pic sắc kí. 200. 0 225. 0 250. 0 275. 0 300. 0 325. 0 350. 0 n m 0. 0 2. 5 5. 0 7. 5 10. 0 mA U (x10 ) 4.77/ 1.00 32 0 22 0 , nm Độ hấp thụ, mAU Digoxin 200. 0 225. 0 250. 0 275. 0 300. 0 325. 0 350. 0 n m 0. 0 2. 5 5. 0 7. 5 mA U (x10 ) 7.37/ 1.00 19 5 27 6 21 9 , nm Độ hấp thụ, mAU Digitoxin
Pha tĩnh trong đƣợc chọn là cột pha ngƣợc, kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì mới có thể tách các chất phân tích. Pha động trong RP-HPLC thƣờng dùng nƣớc cất là dung môi cơ bản, pha thêm với dung môi phân cực khác với tỉ lệ khác nhau có thể hoà tan với nƣớc, thí dụ nhƣ methanol, acetonitril,…nhƣ vậy rất kinh tế, đây cũng là một ƣu điểm của sắc kí pha ngƣợc.
Tốc độ pha động khi chạy sắc ký ảnh hƣởng không ít đến kết quả sắc ký. Tốc độ pha động cũng là yếu tố quyết định đến tốc độ rửa giải các chất trong cột sắc ký vì nó ảnh hƣởng đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa hai pha tĩnh và động. Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây hiện tƣợng doãng pic, thời gian rửa giải các chất lớn làm giảm tính kinh tế của phƣơng pháp. Khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu không kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tƣợng chen lấn, chồng chéo pic. Vì vậy cần chọn tốc độ pha động phù hợp.
Đối với một hệ pha tĩnh và thành phần pha động đã lựa chọn thì khả năng tách các chất phụ thuộc vào tốc độ pha động. Đối với một cột tách nhất định sẽ có một tốc độ tối ƣu.
Chúng tôi đã khảo sát riêng rẽ từng glycoside tim, rồi khảo sát đồng thời hỗn hợp 02 glycoside tim với chƣơng trình chạy đẳng dòng, tỉ lệ thành phần pha động ACN/H2O thay đổi từ 40/60 đến 70/30, khảo sát ở tốc độ dòng pha động từ 0,5ml/phút đến 1ml/phút.
3.1.5.1. Đối với Digoxin
* Để khảo thành phần pha động đối với việc phân tích digoxin, chúng tôi đo một mẫu chuẩn ở tốc độ dòng cố định là 0,7ml/phút, tỉ lệ dung môi ACN/H2O đƣợc thay đổi từ 40/60 đến 60/40, và kết qủa thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động của digoxin
Tỉ lệ pha động ACN/H2O 40/60 50/50 55/45 60/40
Thời gian lƣu (phút) 7,0 4,77 4,42
4,1
(pic lẫn pic nền) Qua thực nghiệm và kết quả thu đƣợc chúng tôi chọn tỉ lệ pha động ACN/H2O bằng 50/50 để phân tích digoxin.
* Để khảo sát tốc độ dòng pha động, chúng tôi cũng tiến hành đo một dung dịch mẫu chuẩn ở tốc độ 0,5ml/phút đến 1ml/phút, với tỉ lệ pha động cố định là ACN/H2O bằng 50/50. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động của digoxin
Tốc độ dòng (ml/phút) 0,5 0,7 1
Thời gian lƣu (phút) 6,58 4,77 3,5 (sát pic nền)
Với kết quả thu đƣợc, để đảm bảo thời gian phân tích hợp lí, píc chất ra có chân pic gọn không sát, lẫn với chân của pic nền, chúng tôi chọn tốc độ tối ƣu để phân tích digoxin là 0,7 ml/phút.
3.5.1.2. Đối với Digitoxin
* Tƣơng tự đối với việc phân tích digitoxin, chúng tôi đo một mẫu chuẩn ở tốc độ dòng cố định là 0,7ml/phút, tỉ lệ dung môi ACN/H2O đƣợc thay đổi từ 40/60 đến 60/40 để khảo sát tỉ lệ dung môi pha động và kết qủa thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động của digitoxin
Tỉ lệ pha động
ACN/H2O 40/60 50/50 60/40 70/30
Thời gian lƣu (phút) 37,4 12,87 7,65 5,88
Diện tích píc 608463
(pic doãng) 773666 778302 767572
Với kết quả thu đƣợc tôi thấy, ở tỉ lệ pha động là ACN/H2O = 40/60 thì thời gian lƣu của digitoxin rất dài (37,4 phút), kết quả phân tích ở tỉ lệ pha động là ACN/H2O = 60/40 tốt hơn cả về tiết kiệm thời gian phân tích và tiết kiệm dung môi. Do đó, chúng tôi quyết định chọn tỉ lệ pha động ACN/H2O = 60/40 là tốc độ tối ƣu để khảo sát các bƣớc tiếp theo đối với digitoxin.
*Tiếp theo, để khảo sát tốc độ dòng pha động trong việc phân tích digitoxin, chúng tôi cũng tiến hành đo một dung dịch mẫu chuẩn ở tốc độ 0,5ml/phút đến 1ml/phút, với tỉ lệ pha động cố định là ACN/H2O bằng 60/40. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động của digitoxin
Tốc độ dòng (ml/phút) 0,5 0,7 1
Thời gian lƣu (phút) 10,47 7,52 5,4 (Spic nhỏ)
Qua thực nghiệm và kết quả thu đƣợc, chúng tôi thấy ở tốc độ pha động là 1ml/phút thì diện tích pic thu đƣợc nhỏ hơn diện tích pic thu đƣợc ở các tốc độ khác, còn với tốc độ pha động là 0,5 ml/phút thì thời gian phân tích dài. Vì vậy, dựa trên kết quả thực nghiệm, chúng tôichọn tỉ lệ pha động ACN/H2O bằng 60/40, và tốc độ tối ƣu bằng 0,7ml/phút để phân tích digitoxin.