Phân tích định lƣợng xác định một số glycoside tim trong dƣợc liệu và dƣợc phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha đảo (RP- HPLC), detector PDA.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu dƣợc phẩm: Hiện nay trong y học hiện chỉ còn digoxin và digitoxin là hai chất trong nhóm glycoside tim đƣợc dùng ở lâm sàng trong điều trị bệnh tim còn lƣu hành rộng trên thị trƣờng. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn một số mẫu thuốc có chứa digoxin và digitoxin, các mẫu thuốc này đƣợc mua tại các hiệu thuốc ở Hà Nội. Thông tin về mẫu thuốc đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Thông tin về mẫu được chọn phân tích
TT Tên mẫu Loại mẫu thuốc Xuất xứ
1 Mẫu 1 Digoxin – Richter Hungary
2 Mẫu 2 Digoxine nativelle Pháp
3 Mẫu 3 DioxineQualy
0,25mg Việt Nam
Mẫu dƣợc liệu: Nhƣ đã đề cập trong phần tổng quan, nguồn dƣợc liệu có chứa glycoside tim mà phân bố nhiều ở nƣớc ta đó chính là cây trúc anh đào. Để góp phân vào việc tìm tòi nghiên cứu tìm nguồn nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh, chúng tôi quyết định chọn mẫu dƣợc liệu là lá trúc anh đào. Lá cây đƣợc hái vào tháng 3 năm 2015, tại đƣờng trong khu đô thị Đại kim – Hà Nội. Lá đƣợc hái đem phơi (tránh ánh trực tiếp), sấy khô, sau đó gói kín trong nilon sạch để sử dụng.
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị
2.2.1. Chất chuẩn
Các chất chuẩn digoxin và digitoxin đƣợc mua ở Viện kiểm nghiệm dạng rắn, với độ tinh khiết 99,2%. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc cân trên cân phân tích từ chất chuẩn và pha với etanol của Merk, cụ thể:
Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn glycoside tim
STT Tên chất Khối lƣợng cân Nồng độ (ppm)
1 Digoxin 0,025 gam 1000 Định mức đến 25ml
bằng etanol 80%
2 Digitoxin 0,025 gam 1000 Định mức đến 25ml
bằng etanol.
Các dung dịch chuẩn tƣơng ứng 100ppm đƣợc pha từ dung dịch 1000ppm tƣơng ứng. Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc 1000ppm định mức đến 10ml bằng etanol. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ dƣới 4oC. Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha từ dung dịch gốc hàng ngày, tuỳ theo mức nồng độ sử dụng.
2.2.2. Hoá chất
- Các dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao: ACN (Merk – Đức) - Dung môi pha chất chuẩn: etanol (Merk – Đức)
- Nƣớc cất đƣợc sử dụng là nƣớc cất hai lần đã đƣợc đeion hoá.
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị:
- Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD – M10Avp.
- Cân phân tích Scientech SA 210, độ chính xác 0,0001 g. - Máy rung siêu âm, có gia nhiệt.
Dụng cụ: - Bình định mức: 10, 25, 50 ml, cùng hãng. - Pipet thƣờng 5, 10 ml - Pipetman các loại từ 0 – 1000µl. - Ống thủy tinh 20 ml. - Cốc 100, 50, 25 ml, cốc cân... - Màng lọc 0,45 µm.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải đƣợc rửa sạch, tráng bằng nƣớc cất, sau đó tráng bằng ACN ba lần và để khô trƣớc khi sử dụng.
2.3. Phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu thuốc: Tham khảo trong tài liệu [1, 12, 14, 24] và qua quá trình thực nghiệm nghiên cứu, chúng tôi đƣa ra quy trình xử lí mẫu phân tích nhƣ sau: Cân 20 viên, tính khối lƣợng trung bình viên rồi nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lƣợng bột tƣơng ứng khối lƣợng của một viên là 0,15 gam đối với loại thuốc trong mẫu 2 và mẫu 3 (xem thông tin trong bảng 2.1) và 0,10 gam đối với mẫu 1 (thông tin trong bảng 2.1) cho vào ống thuỷ tinh 20ml. Thêm 2ml etanol ngâm trong hai phút, thêm tiếp 4ml dung dịch ACN 50%, rung siêu âm 30 phút để chất phân tích có trong thuốc tan hết. Sau đó tiến hành lọc qua màng lọc 0,45m, lấy dịch lọc, phần cặn tiếp tục lọc 3 lần với ACN50% (mỗi lần khoảng 1ml) qua màng lọc 0,45m, gộp toàn bộ dịch lọc định mức 10ml bằng dung dịch ACN 50% và tiến hành phân tích HPLC. Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện với cùng quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu.
Mẫu dƣợc liệu: Lá trúc đào khô đem tán nhỏ (xay nhỏ), cân 10 gam lá đã tán nhỏ cho vào bình nón có dung tích 250ml. Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24
axetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc vào cốc dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm 1 giọt chì axetat xem còn kết tủa không. Nếu còn kết tủa thì thêm tiếp chì axetat vào đếnk khi không còn kết tủa nữa. Sau đó chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình dung tích 100ml. Chiết glycoside tim bằng cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml. Gạn lớp cloroform vào cốc sạch đã sấy khô, gộp các dịch chiết cloroform và loại nƣớc bằng natrisunphat khan. Cho dịch chiết vào nồi cách thuỷ để bốc hơi đến khô. Chất rắn thu đƣợc đƣợc hoà tan bằng ACN55% vừa đủ 10ml. Mang dung dịch này phân tích trên hệ thống HPLC [9, 19].
2.3.2. Phương pháp phân tích.
Phép phân tích các glycoside đƣợc thực hiện trên hệ sắc kí lỏng hiệu năng cao của Shimadzu, kết nối vớ hệ bơm gồm 4 kênh: bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode – array (PDA) đặt ở bƣớc sóng 225 nm. Các điều kiện chạy máy đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
- Nhiệt độ cột 30oC - Van bơm mẫu 20l
- Hệ pha động gồm 2 kênh: kênh A là H2O, kênh C là ACN
- Chế độ chạy đẳng dòng, với tốc độ pha động là 0,7ml/phút. Tổng thời gian chạy 1 mẫu là 15 phút.
2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ưu
Các điều kiện tối ƣu trên máy sử dụng cũng nhƣ quá trình sử lí mẫu đã đƣợc khảo sát
Đầu tiên là khảo sát thành phần dung môi pha động đối với từng glycoside tim, và đối với hỗn hợp glycosde tim. Đối với digoxin các tỉ lệ của 2 dung môi ACN/H2O đƣợc lựa chọn để khảo sát từ 40/60 đến 55/45, với digitoxin tỉ lệ pha động ACN/H2O đƣợc khảo sát từ 40/60 đến 70/30, còn với hỗn hợp glycoside tim tỉ lệ này đƣợc khảo sát từ 45/55 đến 60/40. Sau khi lựa chọn đƣợc tỉ lệ pha động chúng tôi tiếp tục khảo sát tốc độ dòng pha động, tốc độ dòng đƣợc chọn để khảo sát từ 0,5 – 1ml/phút.
2.4.2. Xây dựng đường chuẩn
Để phù hợp với thiết bị sắc kí lỏng HPLC – PDA, cùng với hàm lƣợng glycoside trong một viên thuốc là 0,25 mg (sau này chúng tôi phá mẫu và định mức 10ml), chúng tôi xây dựng các đƣờng chuẩn của các glycoside với nồng độ từ 5ppm đến 100ppm.
Thông tin về các đƣờng chuẩn của các glycoside đƣợc trình bày trong phần kết quả.
2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
- Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
Tức là: yL = yb + k.Sb Với yb
là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (lớn hơn 20 thí nghiệm). Sb là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn.
1 1 nb bj b j b y y n nb i b bi b b x x n S 1 2 2 ) ( 1 1 Nhƣ vậy : . b L b k S y y b
Mẫu trắng đƣợc pha với nồng độ chất phân tích xb = 0.
Do đó giới hạn phát hiện: . b k S LOD b
Trong trƣờng hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem độ lệch chuẩn của mẫu trắng Sb đúng bằng sai số của phƣơng trình hồi quy, tức là Sb = Sy và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yb = a. Khi đó tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD = a + k.Sy. Với độ tin cậy 95%, k = 3. Sau đó dùng phƣơng trình hồi quy có thể tìm đƣợc LOD.
- Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
YQ = yb+ K. Sb
Thông thƣờng LOQ đƣợc tính với K = 10 tức là CQ = 10.SB/b. Hay S/N = 10 nên suy ra LOQ = 3,33 LOD.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp:
Giới hạn phát hiện (Method detection limit-MDL) và giới hạn định lƣợng (Method quantity limit-MQL) của phƣơng pháp phân tích đối với digoxin và digitoxin không chỉ phụ thuộc vào LOD, LOQ của thiết bị phân tích mà còn chịu ảnh hƣởng bởi qui trình phân tích và tay nghề của ngƣời phân tích. Với giả thiết quá trình làm sạch mẫu đã loại bỏ đƣợc các chất gây ảnh hƣởng, tín hiệu nền thấp và ổn định thì công thức tính MDL dựa trên LOD nhƣ sau:
MDL = LOD.V
m
Trong đó: -MDL: giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp đối với chất phân tích (mg/kg mẫu khô).
-LOD: giới hạn phát hiện của thiết bị đối với chất phân tích (ppm hay mg/l).
-V: thể tích dịch chiết (ml).
-m: khối lƣợng mẫu phân tích (g mẫu khô).
Để xác định MDL của phƣơng pháp chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên một mẫu thuốc chứa digoxin, digitoxin (lƣợng mẫu cân 0,15 gam) và tiến hành xử lý mẫu nhƣ mục 2.3.1, tiến hành làm lặp 6 lần (từ khâu cân mẫu). Do chƣa tìm đƣợc mẫu thuốc nào có chứa digitoxin, nên chúng tôi tiến hành thêm digitoxin chuẩn vào mẫu sao cho lƣợng digitoxin trong dung dịch chiết khoảng 25ppm. Tiến hành làm lặp 6 lần.Giới hạn phát hiện LOD của phƣơng pháp đƣợc tính theo công thức: LOD = 3s, trong đó s: độ lệch chuẩn. Giới hạn định lƣợng LOQ của phƣơng pháp = 3,33LOD.
2.4.4. Đánh giá phương pháp phân tích
Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính chính xác, đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại. Trong nghiên cứu của chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị dựa trên độ lặp lại diện tích pic và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn các glycoside đã đƣợc chọn. Mẫu đƣợc bơm vào hệ 5 lần sau đó lấy diện tích và thời gian lƣu trung bình của các lần và tính đƣợc giá trị %RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp lại cần khảo sát.
Sau khi có đủ điều kiện tối ƣu, chúng tôi tiến hành dựng đƣờng chuẩn 02 glycoside đã khảo sát và thu đƣợc 02 phƣơng trình đƣờng chuẩn.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lí mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Cùng một mẫu thực đƣợc cân với khối lƣợng giống nhau, xử lí cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau quá trình sử lí đƣợc bơm 3 lần để thu đựơc hàm lƣợng trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp sử lí mẫu.
Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp sử lí mẫu. Mẫu đƣợc thêm một lƣợng nhất định các glycoside chuẩn vào ở 2 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng chất sau khi xử lý không bị vƣợt qua đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký
3.1.1. Van bơm mẫu
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lí cơ bản là mẫu ban đầu đƣợc nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xilanh ở áp suất thƣờng, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp vào trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lƣợng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi đựơc lƣợng mẫu bơm vào vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần mở rộng chân pic sắc ký –làm cho pic doãng. Nếu nhƣ vòng mẫu quá dài, lựơng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng pic xảy ra càng lớn, gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách. Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng rất lớn
Lƣợng mẫu đƣợc xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu>Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng đƣợc nữa, pic sẽ doãng, tù và không sắc nét nữa. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng [3,6,7].
Hiện nay, van bơm mẫu sáu chiều rất phổ biến, do đó chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích vòng bơm mẫu là 20l.
3.1.2. Cột tách
Với sắc ký HPLC thì cột tách hay pha tĩnh có vai trò rất quan trọng, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình. Bản chất pha tĩnh quyết định đến cơ chế tách và khả năng lƣu giữ của chất tan. Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích mà chọn
pha tĩnh cho phù hợp. Kích thƣớc hạt nhồi, chiều dài cột phải phù hợp với quá trình tách và xác định chất [7].
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn cột pha đảo RP-HPLC để phân tích, trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách C18 inertsil ODS-3 (250mm × 2,1mm × 5µm) để phân tích, tách và định lƣợng các glycoside. Nhiệt độ cột 300
C.
3.1.3. Detector
Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp, thông thƣờng để theo dõi chất phân tích có hai cách: loại theo dõi tính chất của pha động và loại theo dõi tính chất của chất phân tích từ trong pha động chảy ra một cách liên tục. Trên thực tế cũng cần lƣu ý là sự theo dõi không hoàn toàn là tính chất pha động hay chất tan mà là cả hai, với mức độ khác nhau. Các loại detector thông dụng là UV-VIS, huỳnh quang, điện hoá và độ dẫn. Trên thực tế, hầu hết các chất phân tích đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV-VIS, do đó detector UV-VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu và hầu hết các thiết bị sắc kí lỏng đƣợc trang bị loại detector này. Một kỹ thuật mới phát triển gần đây trong detector UV-VIS sử dụng diode array, chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS[3,6,7]. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện và phân tích chất phân tích.
3.1.4. Bước sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim
Hai chất glycoside tim đƣợc nghiên cứu trong bản luận văn này là digoxin và digitoxin. Cả hai chất này có bƣớc hấp thụ quang cực đại giống nhau là đều ở 220nm. Dải phổ hấp thụ của các glycoside tim này đƣợc quét trên detector PDA từ 190 nm đến 370 nm. Hình 3.1 là phổ UV của 02 glycoside:
Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim
Trong nghiên cứu này chúng tôi thấy rằng, tín hiệu pic của chất phân tích ở bƣớc sóng 220 nm và 225 nm có diện tích pic tƣơng đuơng nhau, nhƣng trong quá trình đo chúng tôi thấy tín hiệu đo ở bƣớc sóng 225 nm ổn định hơn, và ảnh hƣởng