6. Đóng góp mới của đề tài
2.2.2.5. Xác định hàm lượng prolin
- Phương pháp: Sử dụng phương pháp của Bates (1973) theo mô tả của Đinh Thị Phòng, có cải tiến (2001), [22].
- Cách lấy mẫu: Cân 0,25g hạt đã nảy mầm (không lấy phần vỏ hạt) và 0,5g đối với lá cây (lấy lá tầng thứ 3 từ trên xuống) cho mỗi giống.
- Cách tiến hành:
+ Lấy mỗi mẫu 0,25g đối với hạt mầm và 0,5g đối với lá cây, nghiền kỹ với 5 ml dung dịch axit sunfosalixylic 3%, thêm 5 ml sunfosalixylic trộn đều, tráng cối chày sứ bằng 5 ml sunfosalixylic nữa và trộn đều toàn bộ hỗn hợp. Li tâm 6000 vòng/phút trong thời gian 3 phút, thu lấy dịch trong (V).
+ Lấy 2 ml dịch chiết (V1) cho vào bình (hoặc ống nghiệm) thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin - axit (dung dịch này gồm 30 ml axit axetic + 1,25g ninhydrin) đậy kín và ủ trong nước nóng 100o
C trong vòng 1 giờ. Sau đó ủ trong khay đá trong vòng 5 phút và bổ sung thêm vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều, lấy dịch màu ở phía trên đem đi đo mật độ quang học ở bước sóng 520 nm trên máy quang phổ.
+ Hàm lượng axit amin được tính theo công thức sau : Y = 1,4083X + 0,014
Công thức xây dựng từ việc lập đường chuẩn prolin, hệ số tương quan R2 = 0,9991.
Trong đó:
Y: Là hàm lượng prolin được tính bằng μg/l
31
Quy đổi ra hàm lượng μg/g mẫu như sau: A = 1000 Y V P Trong đó: A: Là μg/g prolin/gam mẫu P: Khối lượng mẫu phân tích
V: Thể tích dịch mẫu thu được sau khi chiết. 1000: Hệ số quy đổi 1 lít = 1000 ml