6. Đóng góp mới của đề tài
2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.1.1. Thí nghiệm giai đoạn nảy mầm
Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm: Gieo hạt trong phòng thí nghiệm
- Chuẩn bị hạt giống:
+ Chọn hạt giống: Hạt đồng đều, khỏe, có tỷ lệ nảy mầm trên 85%, lấy hạt trong một năm, một nơi nhân ra.
+ Xử lí hạt giống: Ngâm hạt giống trong dung dịch KMnO4 1% trong 3 phút để khử trùng, sau đó rửa lại bằng nước sôi để nguội.
+ Chuẩn bị dụng cụ: Chuẩn bị khay gieo hạt kích thước tương đối của khay là 25 x 15 x 5 cm, giấy thấm gấp nếp. Khay gieo hạt được khử trùng bằng cồn, giấy thấm để đặt lên khay gieo được khử trùng ở nhiệt độ 1300C trong 1h, khi dùng mới lấy.
+ Chuẩn bị hóa chất: Pha dung dịch sorbitol với các nồng độ tương ứng là 3%, 5%, 7%. Xem xét sự biến động các chỉ tiêu ở nồng độ đường khác nhau.
25
+ Tiến hành gieo hạt và xác định các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao.
Cách tiến hành thí nghiệm
- Ngâm hạt giống trong nước khoảng 1h sau đó đem gieo hạt giống lên khay đã để sẵn giấy thấm gấp nếp. Gieo vào mỗi khay 3 hàng, mỗi hàng gieo 10 hạt, nhắc lại 3 lần cho mỗi giống. Tổng số khay gieo là 16 trong đó có 12 khay thí nghiệm và 4 khay đối chứng.
- Bổ sung 5ml nước cất vào mỗi khay đối chứng và 5 ml dung dịch
sorbitol tương ứng 3%, 5%, 7% vào khay thí nghiệm hàng ngày. Để các khay đã gieo hạt trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày xác định một số chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh liên quan tới khả năng nảy mầm của hạt, bao gồm những chỉ tiêu sau:
• Xác định khả năng nảy mầm của hạt trong dung dịch sorbitol
Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều dài rễ mầm đạt từ 3 mm trở lên. Khả năng nảy mầm của hạt được tính theo công thức sau:
P =
b a
x 100%
Trong đó:
P: Khả năng nảy mầm của hạt trong dung dịch sorbitol so với đối chứng a: Là số hạt nảy mầm trong lô thí nghiệm
b: Số hạt nảy mầm ở lô đối chứng
• Khả năng sinh trưởng của mầm trong dung dịch sorbitol
- Sinh trưởng chiều dài mầm (mm): Dùng thước chia đến mm đo chiều dài của mầm từ chóp rễ đến chồi mầm. Thời gian đo sau khi gieo là 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày.
- Khối lượng tươi của mầm (g): Rửa sạch mầm bằng nước cất, dùng giấy thấm thấm sạch nước, tách bỏ phần vỏ hạt, sau đó cân bằng cân phân tích ở thời điểm sau khi gieo 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày.
26
2.2.1.2. Thí nghiệm trồng cây trong chậu
Bố trí thí nghiệm
- Chậu trồng cây bằng nhựa, mỗi chậu chứa khoảng 25 kg đất, đường
kính chậu 30 cm, cao 40 cm.
- Chia các chậu ra làm 2 lô: Lô thí nghiệm gây hạn khi cây bắt đầu ra
hoa và lô đối chứng không gây hạn.
- Tổng số chậu trồng cây là 60 chậu, mỗi chậu trồng 1 cây, mỗi giống
trồng 10 chậu thí nghiệm, và 5 chậu đối chứng. Các chậu thí nghiệm được đặt tại khu nhà lưới, vườn thực nghiệm khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
- Đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường từ khi gieo hạt đến khi cây bắt
đầu ra hoa thì tiến hành gây hạn, lấy mẫu tiến hành xác định các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh vào ngày thứ 5, thứ 7 và thứ 9 sau khi gây héo. Sau đó tưới nước cho những cây còn lại phục hồi.
- Khi quả chín, thu hoạch, xác định một số chỉ tiêu về năng suất
Cách gây hạn
- Các cây trồng được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường đến khi
cây bắt đầu ra hoa, tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước cho đến khi đôi lá cuối cùng bắt đầu héo. Trong quá trình gây hạn, các chậu được che không cho nước mưa có thể vào chậu thí nghiệm, lô đối chứng tưới nước bình thường.
- Tiến hành theo dõi trong vòng 5 ngày kể từ khi lô thí nghiệm bắt đầu có
cây bị héo. Đánh giá tỷ lệ cây không héo, tỷ lệ cây phục hồi sau 5, 7, 9 ngày.
2.2.2. Phương pháp xác định một số chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh
2.2.2.1. Khả năng giữ nước của lá
- Phương pháp: Sử dụng theo phương pháp Kozushko N.N (1984), [10], [22].
27
nhiên.Cắt lá buổi sáng, cùng tầng thứ 3 từ trên xuống, mỗi giống lấy số lượng lá như nhau cho vào túi nilon, đưa nhanh về phòng thí nghiệm.
- Cách tiến hành:
+ Cân nhanh mẫu lá vừa lấy mẫu về bằng cân phân tích có độ chính xác 10-4. Để héo lá tự nhiên 4 giờ, nơi không có ánh nắng chiếu trực tiếp, ở nhiệt độ phòng, để cho chúng mất nước đến trên 40%.
+ Cân lá để xác định khối lượng sau héo và lượng nước đã mất. Sau đó sấy khô lá ở 1050C cho đến khối lượng không đổi (khoảng 3 đến 4 giờ) để tính khối lượng khô.Khả năng giữ nước của lá được tính theo công thức:
A = x 100%
Trong đó:
A: Khả năng giữ nước của lá (%), là % lượng nước mất khi bị héo so với lượng nước tổng số.
B: Khối lượng lá tươi ban đầu (g)
b: Khối lượng lá tươi sau khi gây héo (g) V: Khối lượng khô của lá sau khi sấy (g)
2.2.2.2. Xác định hàm lượng diệp lục tổng số
- Phương pháp: Phương pháp quang phổ, tính hàm lượng diệp lục theo phương trình của Wettstein (1957), [19].
- Cách lấy mẫu: Mẫu lá được lấy ở cùng vị trí, cùng số lá, số mẫu bằng số lần lặp lại của thí nghiệm.
- Cách tiến hành:
+ Cân 40 mg lá tươi cho vào cối sứ nghiền nhỏ, thêm 1 ml axeton 100% và tiếp tục nghiền. Sau đó cho thêm 5 ml axeton và tiếp tục nghiền mẫu đến khi thành khối đồng thể.
+ Li tâm dịch chiết, đổ thêm 2 ml dung dịch axeton. Chuyển dung dịch diệp lục vào bình định mức có dung tích 10 ml, dùng axeton định mức
28
đến vạch. So màu trên máy quang phổ ở bước sóng 662 nm và 644 nm. + Nồng độ diệp được tính theo công thức Wettstein như sau:
Ca (mg/l) = 9,784 x E662 – 0,990 x E644
Cb (mg/l) = 21,426 x E644 – 4,650 x E662
Ca+b (mg/l) = 5,134 x E662 + 20,436 x E644
Hàm lượng diệp lục trong 1g lá tươi được tính theo công thức: 1000
C V A
P (mg/g lá tươi)
Trong đó:
E662, E644: Kết quả so màu dung dịch diệp lục ở bước sóng 662 nm và 644 nm Ca, Cb, Ca+b: Hàm lượng diệp lục a, b và tổng số trong 1 ml dung dịch diệp lục A: Hàm lượng diệp lục trong 1g lá tươi
C: Nồng độ diệp lục trong dịch chiết V: Thể tích dịch mẫu (ml)
P: Khối lượng mẫu (g)
1000: Hệ số quy đổi 1 lít = 1000 ml
2.2.2.3. Xác định hàm lượng diệp lục liên kết
- Phương pháp: Bằng phương pháp đo quang phổ, tính toán theo phương trình của Wettstein (1957), [25].
- Cách lấy mẫu: Mẫu lá được lấy ở cùng vị trí, cùng số lá, số mẫu bằng số lần lặp lại của thí nghiệm.
- Cách tiến hành:
+ Cân 50 mg lá cắt nhỏ cho vào cối sứ nghiền cùng benzen cho tới khi mẫu dính vào đáy cối, loại dung dịch benzen đi, tiếp tục cho thêm benzen vào nghiền, lặp lại cho tới khi dung dịch benzen không nhuộm màu xanh.
+ Loại dung dịch benzen, cho dung dịch axeton 100% vào hòa tan khối mẫu dính ở cối chày sứ. Đưa toàn bộ dung dịch sang phễu lọc rồi tráng lại cối
29
chày sứ bằng axeton. Đưa dịch lọc sang bình định mức 10 ml và dùng axeton dẫn đến vạch. Đem so màu trên máy quang phổ tại bước sóng 662 nm và 644 nm.
+ Tính hàm lượng diệp lục liên kết giống như tính hàm lượng diệp lục tổng số ở trên.
2.2.2.4. Xác định hàm lượng nước liên kết trong lá
- Phương pháp: Sử dụng phương pháp ngâm lá trong dung dịch saccaroza 70% [19].
- Cách lấy mẫu: Mẫu lá được lấy ở cùng vị trí, cùng số lá, số mẫu bằng số lần lặp lại của thí nghiệm.
- Cách tiến hành:
+ Cắt lá vào sáng sớm đưa ngay vào phòng thí nghiệm cân. Ngâm lá trong dung dịch saccaroza 70% trong 6h ở nhiệt độ phòng rồi đem cân lại lá. Sau đó đem sấy khô ở 105oC trong 3h để xác định khối lượng khô của lá. Sự chênh lệch giữa khối lượng tươi và khối lượng khô cho biết lượng nước tổng số của lá (X). Công thức tính hàm lượng nước tự do như sau:
Z = A1 – A2
Trong đó :
Z: Hàm lượng nước tự do (g/lá) A1: Khối lượng lá ban đầu (g/lá)
A2: Khối lượng lá sau khi ngâm trong dung dịch saccaroza 70% (g/lá) + Công thức tính lượng nước liên kết
Y = X – Z
Trong đó:
Y: Hàm lượng nước liên kết (g/lá) X: Hàm lượng nước tổng số (g/lá)
30
+ Quy đổi ra % hàm lượng nước liên kết trong lá theo công thức sau: H =
X Y
x 100%
Trong đó: H là % lượng nước liên kết trong lá so với lượng nước tổng số
2.2.2.5. Xác định hàm lượng prolin
- Phương pháp: Sử dụng phương pháp của Bates (1973) theo mô tả của Đinh Thị Phòng, có cải tiến (2001), [22].
- Cách lấy mẫu: Cân 0,25g hạt đã nảy mầm (không lấy phần vỏ hạt) và 0,5g đối với lá cây (lấy lá tầng thứ 3 từ trên xuống) cho mỗi giống.
- Cách tiến hành:
+ Lấy mỗi mẫu 0,25g đối với hạt mầm và 0,5g đối với lá cây, nghiền kỹ với 5 ml dung dịch axit sunfosalixylic 3%, thêm 5 ml sunfosalixylic trộn đều, tráng cối chày sứ bằng 5 ml sunfosalixylic nữa và trộn đều toàn bộ hỗn hợp. Li tâm 6000 vòng/phút trong thời gian 3 phút, thu lấy dịch trong (V).
+ Lấy 2 ml dịch chiết (V1) cho vào bình (hoặc ống nghiệm) thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin - axit (dung dịch này gồm 30 ml axit axetic + 1,25g ninhydrin) đậy kín và ủ trong nước nóng 100o
C trong vòng 1 giờ. Sau đó ủ trong khay đá trong vòng 5 phút và bổ sung thêm vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều, lấy dịch màu ở phía trên đem đi đo mật độ quang học ở bước sóng 520 nm trên máy quang phổ.
+ Hàm lượng axit amin được tính theo công thức sau : Y = 1,4083X + 0,014
Công thức xây dựng từ việc lập đường chuẩn prolin, hệ số tương quan R2 = 0,9991.
Trong đó:
Y: Là hàm lượng prolin được tính bằng μg/l
31
Quy đổi ra hàm lượng μg/g mẫu như sau: A = 1000 Y V P Trong đó: A: Là μg/g prolin/gam mẫu P: Khối lượng mẫu phân tích
V: Thể tích dịch mẫu thu được sau khi chiết. 1000: Hệ số quy đổi 1 lít = 1000 ml
2.2.2.6. Các yếu tố cấu thành năng suất - Phương pháp: Sử dụng cân kĩ thuật. - Phương pháp: Sử dụng cân kĩ thuật.
- Cách lấy mẫu: Thu hoạch quả đã chín ở các giai đoạn
- Các chỉ tiêu cần xác định:
+ Số lượng quả (quả/cây)
+ Khối lượng quả trên cây (kg/cây) + Khối lượng trung của bình quả (g/quả)
2.3. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Các kết quả nghiên cứu được xử lí và đánh giá theo phương pháp thống kê sinh học nhờ phần mềm phần mềm SPSS, Microsoft Excel 2010, thông qua các tham số sau, so sánh 2 trung bình mẫu với mức ý nghĩa α = 0,05.
X = n X n i i 1 ; 2 = 1 1 2 n X X n i i (nếu n < 30) 2 = 2 1 ( ) n i i X X n (nếu n ≥ 30); = 2 ; m = n Trong đó: X : Giá trị trung bình số học n: Số lần nhắc lại m: Sai số trung bình số học : Phương sai
32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Các chỉ tiêu nghiên cứu giai đoạn nảy mầm
3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt trong dung dịch sorbitol
Khả năng nảy mầm của hạt là toàn bộ quá trình sinh lí rất quan trọng trong chu kì sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đây là giai đoạn ban đầu nhằm đảm bảo, duy trì sự sống và tạo ra những cơ thể mới. Ở giai đoạn này, nước đóng vai trò là nhân tố quan trọng để đánh giá khả năng nảy mầm của hạt giống. Kết quả nghiên cứu về khả năng nảy mầm của hạt ở 4 giống cà chua với các nồng độ đường khác nhau 3%, 5%, 7% được thể hiện thông qua bảng 2.1, hình 1.
Bảng 2.1. Khả năng nảy mầm của hạt trong dung dịch sobitol
Thời gian Nồng độ % so với đối chứng HT126 HT144 HT152 HT160 5 ngày 3% 96,53 88,40 97,53 99,64 5% 96,40 87,65 96,10 98,30 7% 96,47 86,39 95,91 98,13 7 ngày 3% 92,53 95,34 91,79 91,41 5% 90,83 95,06 91,70 91,10 7% 89,94 94,90 91,47 89,85 9 ngày 3% 98,71 84,36 86,95 87,41 5% 96,84 83,79 86,81 87,34 7% 94,36 83,09 81,49 86,05
Từ bảng 2.1 cho thấy, nồng độ sorbitol khác nhau có ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của các giống cà chua. Nồng độ sorbitol càng cao thì áp suất thẩm
33
thấu càng cao, ảnh hưởng đến khả năng hút nước của hạt.
Sau 5 ngày gieo hạt, tỷ lệ hạt nảy mầm chênh lệch nhau chưa rõ ở các nồng độ. Ở 2 giống HT144, HT152 % về khả năng nảy mầm so với đối chứng giảm dần ở các nồng độ 3%, 5%, 7%. Cụ thể, giống HT144 đạt lần lượt là 88,40%; 87,65%; 86,39%, giống HT152 đạt 97,53%; 96,10%; 95,91%. Ở thời điểm này sự khác biệt giữa gieo hạt trong lô thí nghiệm và đối chứng là không nhiều, cơ chế thích nghi cũng chưa bộc lộ rõ khi lựa chọn nồng độ đường sorbitol thấp.
Sau 7 ngày gieo hạt, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ 3% đạt từ 91,41% -
95,34%, ở nồng độ 5% đạt từ 90,83% - 95,06% so với đối chứng. Ở nồng độ cao 7% tỷ lệ nảy mầm thấp hơn đạt từ 89,85% - 94,90% so với đối chứng.
Sau gieo hạt 9 ngày, chúng tôi nhận thấy sự sai khác rõ nhất về tỷ lệ nảy mầm của các giống, ở nồng độ 3% tỷ lệ nảy mầm cao hơn và dao động trong biên độ 84,36% - 98,71%, ở nồng độ 5% dao động 83,79% - 96,84%, ở nồng độ 7% dao động 81,49% - 94,36% so với đối chứng.
Căn cứ vào kết quả thí nghiệm, tỷ lệ nảy mầm của hạt cà chua trong các nồng độ sorbitol khác nhau, chúng tôi thấy rằng ở nồng độ sorbitol thấp 3%, 5% tỷ lệ nảy mầm tương đối cao, tác động của của áp suất thẩm thấu không rõ rệt. Ở nồng độ sorbitol cao 7% tỷ lệ nảy mầm thấp hơn, tác động của áp suất thẩm thấu càng thể hiện rõ ràng đến khả năng nảy mầm và tính chống chịu của giống. Dựa vào kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy nồng độ sorbitol 7% có thể phân loại rõ về khả năng nảy mầm của 4 giống cà chua giữa các công thức đối chứng và thí nghiệm.
Trong thí nghiệm gieo hạt cà chua ở các độ dung dịch sorbitol 3%, 5%, 7% thì tỷ lệ nảy mầm tỷ lệ nghịch với nồng độ sorbitol. Ở nồng độ sorbitol cao 7% thì giống HT126 cho tỷ lệ nảy mầm là cao nhất đạt 94,36% so với đối chứng sau khi gieo 9 ngày, sau đó là giống HT160, HT152, HT144.
34
Hình 1. Khả năng nảy mầm của hạt trong dung dịch sorbitol
3.1.2. Khả năng sinh trưởng của mầm trong dung dịch sorbitol
3.1.2.1. Sinh trưởng chiều dài mầm
Chiều dài của mầm phản ánh tốc độ sinh trưởng phát triển của giống, ở giai đoạn này nước là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh lí của mầm. Sự nảy mầm bắt đầu từ sự hút nước mạnh, phần lớn nước được hấp thụ đi vào phôi, quá trình trao đổi chất được hoạt hóa nhờ sự gia tăng cường độ hô hấp. Kết quả thí nghiệm của sự sinh trưởng chiều dài mầm được thể hiện qua bảng 3.1, hình 2.
Chúng tôi tiến hành đo chiều dài mầm vào các ngày thứ 5, ngày thứ 7 và