2.7.1. Công dụng của chlorine
Chlorine có 2 dạng phổ biến thƣờng dung là Calcium hypochloride (Ca(OCl)2) và
sodium hypochloride (NaOCl).
Chlorine đƣợc sản xuất ở các dạng bột, lỏng, viên. Chlorine dạng bột Ca(OCl2) và lỏng NaOCl là chất khử trùng nƣớc đƣợc dùng phổ biến hơn 1 thế kỷ qua. Trong các xí nghiệp chế biến thủy sản, chlorine đƣợc dùng phổ biến nhất là Ca(OCl2) để xử lý nguyên liệu.
Chlorine có tính diệt khuẩn rất cao, có thể giết chết hoặc ức chế sự phát triển của tảo, nấm mốc, vi sinh vật có hại nhƣ: Salmonella, Listeriamonocytogenenes, E. coli,… HOCl và OCl- làm biến tính enzyme hay protein, phá vỡ cấu trúc vật lý của tế bào là cho các vi sinh vật không hoạt động.
Ngoài ra chlorine còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhƣ: Xử lý nƣớc uống, thành phần của thuốc chữa bệnh, thành phần quan trọng trong dụng cụ y khoa, sử dụng trong bao bì một số loại thuốc để kéo dài thời gian bảo quản,…
2.7.2. Tác hại của chlorine
Khi ở dạng khí chlorine là khí độc, kích thích hệ hô hấp, màng nhầy, mắt và da, có khả năng phản ứng với hơi ẩm tạo acid chlorhydric (HCl) và acid hypochloruos
(HClO), cả 2 acid này đều là chất ăn mòn và có thể rất nguy hiểm.
Khi ở dạng lỏng chlorine là một hóa chất độc, có mùi cay nồng khó chịu có khả năng ăn mòn lớn, gây bỏng da, mắt. Ngoài ra, chlorine khi kết hợp với các hợp chất hữu cơ tạo nên các sản phẩm phụ gốc halogen có khả năng gây ung thƣ nhƣ:
Trihalomethane, haloacetic, cloramine,…
2.7.3. Thực trạng sử dụng chlorine tại các xí nghiệp
Chlorine đƣợc sử dụng để khử trùng tại các xí nghiệp chế biến thủy sản ở dạng muối calcium hypochloride có công thức hóa học là Ca(OCl)2.
Hiện nay, các xí nghiệp sử dụng chlorine để rửa nguyên liệu thủy sản chủ yếu ở các nồng độ 50 ppm, 100 ppm. Các mức nồng độ thấp hơn (20 ppm, 10 ppm) ít đƣợc sử dụng do yêu cầu đảm bảo hàm lƣợng vi sinh trong nguyên liệu nhỏ hơn mức cho phép để xuất khẩu. Điều này cho thấy có một lƣợng chlorine dƣ hơn mục đích cần dùng đã đƣợc sử dụng. Do đó, đòi hỏi phải có sự hạn chế sử dụng chlorine trong mức cho phép để đảm bảo sức khỏe của mọi ngƣời.
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
3.1.1. Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng trƣờng Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thời gian thí nghiệm
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 05/8/2013 đến ngày 15/11/2013
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 3.2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng
- Nƣớc cất, cồn 96 o, cồn 70 o, NaCl 0,9%
- MacConkey agar (MC)
- Nutrient agar (NA) - Nutrient broth (NB) - Acid acetic 1%, 1,5%, 2% - Chlorine 30 ppm - Nƣớc nóng nhiệt độ 70 o C, 75 oC, 80 oC - Cá tra 3.2.2. Thiết bị sử dụng - pH kế - Nhiệt kế
- Máy đo cấu trúc Rheotex
- Tủ sấy vô trùng, tủ ấm, buồng cấy vô trùng, Autoclave, cân điện tử, thùng đựng mẫu, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấy trang, găng tay và một số dụng cụ phòng thí nghiệm khác.
3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa theo quá trình xử lí rửa miếng cá tra fillet. Từ đó thay thế dung dịch rửa thƣờng sử dụng là chlorine bằng phƣơng pháp rửa bằng dung dịch acid acetic, phƣơng pháp rửa nƣớc nóng và sự kết hợp giữa 2 phƣơng pháp, so sánh chất lƣợng nguyên liệu khi đƣợc xử lí bằng các phƣơng pháp khác nhau so với việc xử lí bằng chlorine. Kết quả đƣợc thống kê bằng chƣơng trình Statgraphic 15.2.11.0 và xử lý bằng Excel 2003
3.3.1. Bố trí thí nghiệm
3.3.1.1. Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 3.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Nguyên liệu Fillet Lạng da Chỉnh hình Bảo quản (4 oC) Kiểm tra chất lƣợng Kết hợp nƣớc nóng (nhiệt độ tối ƣu) và acid acetic Nƣớc nóng Acid acetic 1 Đối chứng 1 Làm nhiễm E. coli Tăng sinh E. coli
Kiểm tra mật số ban đầu
Rửa 2 Kiểm tra mật số dịch khuẩn
3.3.1.2. Bố trí thí nghiệm
a. Thí nghiệm đối chứng
- Mục đích: Xác định khả năng ức chế sự phát triển của E. coli và vi sinh vật tổng số hiếu khí của chlorine. Kết quả đối chứng với các thí nghiệm còn lại
- Chuẩn bị:
+ Dung dịch chlorine 30 ppm + Cá tra fillet.
+ Chủng vi sinh vật E. coli đã đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB trong 48 giờ. - Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố và 3 lần lặp lại. Vậy tổng số mẫu là: 1 x 3 = 3 mẫu
- Tiến hành: Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ hình 3.2. Nguyên liệu cá tra sau khi fillet, lạng da và chỉnh hình đƣợc rửa sạch để loại tạp chất, mỡ và vi sinh vật bám trên cá. Sau đó, mẫu cá đƣợc làm nhiễm vi khuẩn E. coli bằng cách ngâm vào dịch khuẩn E. coli theo tỉ lệ (100 ml dịch khuẩn /60 g cá) trong 5 phút sau đó vớt ra để yên trong 30 phút. Lấy mẫu kiểm tra mật số vi sinh vật nhiễm vào mẫu trƣớc khi xử lý. Sau đó, xử lý mẫu bằng cách ngâm vào dung dịch chlorine nồng độ 30 ppm theo tỉ lệ (300 ml dung dịch/ 50 g) cá trong 2 phút. Lấy mẫu kiểm tra lại mật số vi sinh vật sau khi xử lý. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4 oC trong 1 tuần, kiểm tra lại mật số vi sinh vật.
Sử dụng mẫu sạch thực hiện ngâm vào dung dịch tƣơng tự nhƣ trên xác định pH và cấu trúc mẫu.
- Chỉ tiêu phân tích: + Cấu trúc
+ pH
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối chứng
b. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ của acid acetic đến khả năng ức chế sự phát triển của E. coli và vi sinh vật tổng số hiếu khí.
- Mục đích: Xác định nồng độ tối ƣu của acid acetic đến khả năng ức chế sự phát triển của E. coli và vi khuẩn tổng số hiếu khí.
- Chuẩn bị:
+ Dung dịch acid acetic với 3 nồng độ khác nhau. + Cá tra fillet
+ Chủng vi sinh vật E. coli đã đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB trong 48 giờ. - Tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm đối chứng, thay thế dung dịch chlorine 30 ppm bằng dung dịch acid acetic có nồng độ thay đổi lần lƣợt là 1%, 1,5%, 2% trong 2 phút.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố, mỗi nhân tố có 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Vậy tổng số mẫu là: 3 x 3 = 9 mẫu
Nhân tố A là nồng độ dung dịch cần khảo sát: A1: 1%
A2: 1,5% A3: 2%
- Chỉ tiêu phân tích: Tƣơng tự thí nghiệm đối chứng
Nguyên liệu Rửa 2 ……… 1 Chlorine 30 ppm ………….
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
c. Thí nghiệm 2: khảo sát nhiệt độ nƣớc nóng đến khả năng ức chế sự phát triển của E. coli và vi sinh vật tổng số hiếu khí.
- Mục đích: Xác định nhiệt độ tối ƣu của nƣớc nóng đến khả năng ức chế sự phát triển của E. coli và vi khuẩn tổng số hiếu khí.
- Chuẩn bị:
+ Nƣớc nóng với 3 nhiệt độ khác nhau. + Cá tra fillet.
+ Chủng vi sinh vật E. coli đã đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB trong 48 giờ. - Tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm đối chứng, thay thế dung dịch chlorine bằng nƣớc nóng có nhiệt độ khác nhau lần lƣợt là 70 oC, 75 oC, 80 oC trong 15 giây. - Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố, mỗi nhân tố có 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Vậy tổng số mẫu là: 3 x 3 = 9 mẫu Nhân tố B là nhiệt độ cần khảo sát B1: 70 oC
B2: 75 oC B3: 80 oC
- Chỉ tiêu phân tích:tƣơng tự thí nghiệm đối chứng
Rửa 2 Nguyên liệu ……….. 1 Acid acetic A1 A2 A3 ………..
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
d. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự kết hợp giữa nƣớc nóng và nồng độ acid acetic đến khả năng ức chế sự phát triển của E.coli và vi sinh vật tổng số hiếu khí.
- Mục đích: Xác định nồng độ acid acetic tối ƣu khi kết hợp với nƣớc nóng đến khả năng ức chế sự phát triển của E.coli và vi sinh vật tổng số hiếu khí.
- Chuẩn bị:
+ Nƣớc nóng có nhiệt độ tối ƣu ở thí nghiệm 2 + Dung dịch acid acetic có 3 nồng độ khác nhau.
+ Chủng vi sinh vật E.coli đã đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB trong 48 giờ. - Tiến hành: Tƣơng tự thí nghiệm đối chứng, thay thế dung dịch chlorine bằng cách rửa nƣớc nóng có nhiệt độ tối ƣu ở thí nghiệm 2 trong 15 giây sau đó ngâm vào dung dịch acid acetic có nồng độ khác nhau lần lƣợt là 1%, 1,5%, 2% trong 1 phút.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố, mỗi nhân tố có 3 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Vậy tổng số mẫu là: 3 x 3 = 9 mẫu C1: 1% C2: 1,5% Rửa 2 Nguyên liệu ……….. 1 Nƣớc nóng B1 B2 B3 ………..
C3: 2%
- Chỉ tiêu phân tích:tƣơng tự thí nghiệm đối chứng
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 Rửa 2 Nguyên liệu ……….. 1 Nƣớc nóng (tối ƣu) C1 C2 C3 ……….. Acid acetic
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ACID ACETIC ĐỐI VỚI SỰ THAY ĐỔI MẬT SỐ VI SINH VÂT , CẤU TRÚC, pH CÁ TRA. ĐỔI MẬT SỐ VI SINH VÂT , CẤU TRÚC, pH CÁ TRA.
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra độ giảm mật số của E. Coli trên miếng cá tra fillet ở các nồng độ xử lý acid acetic khác nhau theo thời gian bảo quản (log10 cfu/g)
Nghiệm thức
Thời gian bảo quản ở 4oC (ngày)
0 7
1% 0,51b 1,65a
1,5% 1,01a 1,46a
2% 1,35a 0,82b
Đ/C 1,46a 0,25c
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 0,05
Độ giảm = (log10 cfu/g trước xử lý) – (log10 cfu/g sau xử lý)
Kết quả kiểm tra độ giảm mật số E. coli (Bảng 4.1) cho thấy:
Ở 0 ngày bảo quản nồng độ acid acetic càng cao thì tác dụng ức chế sự phát triển của E.coli và vi khuẩn hiếu khí tổng số càng mạnh. Do trong dung dịch acid acetic phân ly H+ làm giảm pH của môi trƣờng. Khi pH của môi trƣờng thấp sẽ khử hoạt tính của enzyme, khử đi hoạt động của hệ vận chuyển ion, chất dinh dƣỡng vào tế bào làm ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật (Nguyễn Đức Lƣợng, 2000). Mật số vi sinh vật giảm thấp nhất ở nồng độ acid acetic 1% và cao nhất ở nồng độ acid acetic 2%. Tuy nhiên ở cả 3 nồng độ acid acetic xử lí mật số
E.coli đều giảm thấp hơn mẫu đối chứng. Nhƣng theo kết quả thống kê chỉ có sự khác biệt ý nghĩa đáng kể giữa mẫu đối chứng và nồng độ acid acetic 1%.
Thông thƣờng nồng độ càng cao của một nhân tố hóa học hay cƣờng độ vật lý làm cho tốc độ vi sinh vật chết càng nhanh. Nhƣng hiệu suất của các tác nhân không phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ hay cƣờng độ (Phạm Thị Lan Phƣơng và cộng sự, 2012). Do đó, ở 7 ngày bảo quản, khả năng ức chế sự phát triển của E.coli của dung dịch acid acetic có sự thay đổi rõ rệt. Khả năng duy trì hoạt tính ức chế của dung dịch acid acetic 1% và 1,5% tăng, trong khi đó khả năng ức chế ở nồng độ 2% lại giảm. Nồng độ acid acetic 1% có khả năng duy trì khả năng ức chế vi sinh vật cao nhất và không có sự khác biệt ý nghĩa với nồng độ 1,5%. Khả năng ức chế của mẫu đối chứng giảm mạnh nhất.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra độ giảm mật số vi khuẩn hiếu khí tổng số ở các nồng độ xử lý acid acetic khác nhau theo thời gian bảo quản (log10 cfu/g).
Nghiệm thức
Thời gian bảo quản ở 4 oC (ngày)
0 7
1% 0,68b 1,91a
1,5% 1,16ab 1,60ab
2% 1,55a 0,88bc
Đ/C 1,50a 0,30c
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 0,05
Độ giảm = (log10 cfu/g trước xử lý) – (log10 cfu/g sau xử lý)
Kết quả kiểm tra độ giảm mật số vi khuẩn hiếu khí tổng số (Bảng 4.2) cho thấy: Tƣơng tự nhƣ khả năng ức chế E.coli, đối với vi khuẩn hiếu khí tổng số nồng độ dung dịch acid acetic càng cao khả năng ức chế càng mạnh. Và khả năng duy trì hoạt tính ức chế của dung dịch cũng thay đổi theo thời gian.
Dung dịch acid acetic nồng độ 1% và 1,5% có khả năng ức chế kém ở 0 ngày bảo quản nhƣng có khả năng duy trì hoạt tính tốt, khả năng ức chế tăng lên khi đến ngày bảo quản thứ 7. Dung dịch acid acetic 2% ở 0 ngày bảo quản có khả năng ức chế rất tốt, nhƣng không duy trì đƣợc hoạt tính, đến ngày bảo quản thứ 7 khả năng ức chế giảm xuống thấp.
Qua 2 bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy: Acid acetic có tác dụng ức chế vi sinh vật hiếu khí tổng số cao hơn ức chế E. coli. Khả năng ức chế vi sinh vật của acid acetic tăng dần theo chiều tăng của nồng độ nhƣng khả năng duy trì hoạt tính thì ngƣợc lại có xu hƣớng giảm dần theo chiều tăng của nồng độ. Nhìn chung kết quả ở thí nghiệm 1 cho thấy khả năng ức chế và duy trì hoạt tính ức chế vi sinh vật của acid acetic tốt hơn chlorine.
Hình 4.1: Khuẩn lạc E. coli trƣớc và sau xử lí acid acetic trên môi trƣờng MC
Hình 4.2: Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí tổng số trƣớc và sau xử lí acid acetic trên môi trƣờng PCA
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra cấu trúc cá ở các nồng độ acid acetic theo thời gian bảo quản (g/mm2)
Nghiệm thức
Thời gian bảo quản ở 4 oC (ngày)
0 7
1% 3,15ab 4,00
1,5% 2,80b 5,77
2% 2,33b 4,45
Đ/C 4,48a 3,62
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 0,05
Kết quả ở bảng 4.3 biểu diễn sự thay đổi cấu trúc cá tra cho thấy: Ở 0 ngày bảo quản, xử lí bằng dung dịch acid acetic cấu trúc cá tra giảm dần theo nồng độ acid.
Do nồng độ acid cao làm biến tính protein 1 phần trên bề mặt mẫu xử lí nên ảnh hƣởng đến cấu trúc sản phẩm. Dung dịch acid acetic 1% ít làm biến đổi cấu trúc cá nhất và dung dịch acid acetic 2% làm biến đổi cấu trúc cá nhiều nhất. Tuy nhiên không nhận thấy sự khác biệt về cấu trúc ở các nồng độ xử lí. Ở 7 ngày bảo quản, cấu trúc cá có xu hƣớng tăng so với ban đầu.
Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra pH cá ở các nồng độ acid acetic theo thời gian bảo quản
Nghiệm thức
Thời gian bảo quản ở 4 oC (ngày)
0 7
1% 6,14b 5,88b
1,5% 5,93b 5,56c
2% 5,55c 5,24d
Đ/C 6,83a 6,70a
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 0,05
Kết quả ở bảng 4.4 biểu diễn sự thay đổi pH cá tra cho thấy: Ở 0 ngày bảo quản khi xử lí bằng dung dịch acid acetic có nồng độ càng cao thì pH của sản phẩm càng giảm. pH khi xử lý acid acetic ở nồng độ 1% và 1,5% không có sự khác biệt ý nghĩa song khác biệt với xử lý acid acetic 2% và mẫu đối chứng. Mẫu xử lý 1% có pH gần với mẫu đối chứng nhất. Ở thí nghiệm này pH cá giảm mạnh một phần là do sự phân giải glycogen trong cơ thịt cá sau khi chết, nhƣng chủ yếu do H+ của acid acetic phân ly. Ở 7 ngày bảo quản pH cá tiếp tục giảm, tuy nhiên đến 7 ngày bảo quản thì các nồng độ acid acetic sử dụng để xử lí có sự khác biệt hoàn toàn về thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Ở nồng độ acid acetic xử lí 1 % có pH gần với pH của mẫu