2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. p h sơ bệnh án
- Phần hành chính: Nam giới vô sinh được lập hồ sơ bệnh án theo mẫu để khai thác các thông tin về tuổi, địa chỉ...
- Phần khai thác tiền sử: Nam giới vô sinh được phỏng vấn trực tiếp và trả lời đầy đủ các câu hỏi về tiền sử bệnh lý bản thân, nghề nghiệp, môi trường làm việc, tiền sử mắc bệnh, nhiễm độc, quai bị, chấn thương bộ phận sinh dục, nghiện rượu, thuốc lá... liên quan đến việc tiếp xúc với hóa chất, tia phóng xạ, mắc một số bệnh tật liên quan đến vô sinh.
- Khai thác các kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ, nội tiết, siêu âm, chọc dò và các xét nghiệm khác đã có từ trước.
2.2.2.2. Thăm khám lâm sàng
- Thăm khám thực thể để xác định khả năng sinh sản của nam gồm: Xác định vị trí, kích thước tinh hoàn, dương vật, phát hiện các viêm nhiễm hay bất thường dương vật, tinh hoàn, bìu, tuyến tiền liệt, tĩnh mạch tinh…
- Đánh giá thể tích tinh hoàn bằng chuỗi hạt Prader, xác định mật độ của tinh hoàn. Vị trí, kích thước tinh hoàn được ước lượng theo thể tích tính (ml) bằng cách khi khám tinh hoàn sẽ so sánh với mẫu tinh hoàn có sẵn các thể tích từ 1ml đến 25 ml để ước lượng thể tích tinh hoàn.
Thước đo Prader gồm 12 hạt tương đương với thể tích là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25 ml. Do vậy chúng tôi chia thể tích thành 6 nhóm gồm: ≤ 5; 6-10; 10-15; 15-20; 20-25; > 25 ml.
- Phát hiện những bất thường khác ở bộ phận sinh dục ngoài bằng quan sát, thăm khám, sờ nắn tinh hoàn.
Việc thăm khám đánh giá tinh hoàn được thực hiện tại Bộ môn Y sinh học di truyền do thầy hướng dẫn trực tiếp hướng dẫn và do nghiên cứu sinh thực hiện qua việc hướng dẫn của thầy đã được đào tạo và có nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực này.
2.2.2.3. Xét nghiệm tinh dịch
Các thông số tinh dịch được phân tích là: - Nhóm chứng và nhóm TT/TTN:
+ Thể tích, pH, độ nhớt.
+ Di động: vận tốc trung bình (μm/s), hình thái di động. + Hình thái, tỷ lệ sống của tinh trùng.
- Nhóm vô tinh:
+ Thể tích, pH, độ nhớt.
2.2.2.4. Phân tích NST ở các nam giới vô tinh và thiểu tinh nặng
* Bước 1: Nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D. A. [151].
- Lấy 5 ml máu tĩnh mạch cho vào tuýp vô trùng đã được tráng bằng heparin.
- Nhỏ 4 ml máu toàn phần vào tuýp nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy là Karyotyping Medium của Gibco®.
- Đặt các tuýp nuôi cấy trong tủ ấm 370C thời gian 72 giờ. Trước khi thu hoạch 2 giờ, nhỏ dung dịch colcemid vào môi trường để dừng các tế bào ở kỳ giữa. Thu hoạch giờ thứ 72.
* Bước 2: Thu hoạch tế bào [152]
- Dịch treo tế bào từ tuýp nuôi cấy được chuyển sang ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 800 - 1000 vòng/phút, thời gian 10 phút.
- Sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên, để lại phần cặn tế bào, nhược trương bằng dung dịch KCl, nồng độ 0,075 M. Để trong tủ ấm 370
C, thời gian 45 phút để phá vỡ màng tế bào.
- Định hình NST bằng dung dịch Carnoy với tỷ lệ 3 methanol: 1 acid acetic, để vào tủ lạnh 30 phút, ly tâm 1000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi, giữ lại cặn tế bào. Bước định hình NST được lặp lại 3 lần.
- Lần cuối cùng sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi phía trên, dùng ống hút nhỏ giọt hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào, trong đó có các cụm kỳ giữa rồi dàn đều lên phiến kính sạch đã được để lạnh.
* Bước 3: Nhuộm tiêu bản [152],[153]
- Dàn đều tế bào lên tiêu bản, để tiêu bản khô tự nhiên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiêu bản NST được nhuộm bằng phương pháp nhuộm băng G [153]. * Bước 4: Phương pháp phân tích NST và lập karyotyp theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [154].
- Quan sát NST dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Tìm các tế bào ở kỳ giữa có các NST dàn đều để đếm số lượng NST trong tế bào đó. Trung bình cho mỗi mẫu phải đánh giá ít nhất 30 cụm kỳ giữa, trong trường hợp cần thiết phải phân tích 100 cụm kỳ giữa (những trường hợp nghi là thể khảm).
- Phát hiện và phân tích các rối loạn cấu trúc NST khi đếm số lượng. - Phân tích NST và lập karyotyp theo tiêu chuẩn ISCN với hệ thống karyotyping bằng phần mềm Ikaros.
Tổng hợp các số liệu đánh giá rồi kết luận về số lượng và hình thái cấu trúc NST sau khi đã lập karyotyp của đối tượng nghiên cứu.
2.2.2.5. Phát hiện mất đoạn AZFabcd trên NST Y ở các nam giới VT và TTN
- Thu thập mẫu bệnh phẩm: Mỗi mẫu lấy 2-5 ml máu chống đông bằng EDTA. Tách chiết ADN tổng số từ máu ngoại vi theo quy trình của kit AquaPure genomic DNA (Invitrogen).
- Kỹ thuật mutiplex PCR: Nhân đoạn gen bằng kỹ thuật mutiplex PCR, xác định mất đoạn AZF trên NST Y. Lựa chọn, tổ hợp các cặp mồi thích hợp, tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi.
Có khoảng 300 các trình tự đặc hiệu (STS) ở vùng AZF có thể dùng để chẩn đoán các mất đoạn nhỏ. Tuy nhiên, không thể xét nghiệm tất cả các STS để xác định mất đoạn nhỏ vùng AZF vì giá thành sẽ rất cao và thời gian xét nghiệm dài. Học viện nam học Châu Âu (EAA: European Academy of Andrology) khuyến cáo chỉ cần phân tích 2 STS cho mỗi phân vùng AZF có thể phát hiện trên 90% các mất đoạn nhỏ. Các cặp mồi để xác định các STS được khuyến cáo là: sY84 và sY86 cho AZFa, sY127 và sY134 cho AZFb, sY254 và sY255 cho AZFc. Về nguyên tắc, với các bệnh có nhiều STS chi phối thì ở các khu vực khác nhau, đột biến phổ biến có thể khác nhau. Tuy nhiên, các tác giả khác nhau nghiên cứu ở các nước thuộc các châu lục khác nhau, khi áp dụng các mồi khuyến cáo của EAA đều có kết quả phát hiện được mất đoạn AZFabc tốt [87],[88],[103],[107],[110],[112],[113],[114]. Vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng dùng 6 cặp mồi theo khuyến cáo của EAA để phát hiện mất đoạn nhỏ AZFabc. Để phát hiện thêm mất đoạn nhỏ AZFd là loại mất đoạn gần đây được các tác giả đề cập và có tỷ lệ đột biến cao hơn các vùng AZF khác, chúng tôi dùng sY152 và BPY2 để phát hiện mất AZFd.
+ Theo Học viện Nam học Châu Âu (European Academy of Andrology - EAA) và Mạng lưới kiểm tra chất lượng di truyền phân tử Châu Âu (European Molecular Genetics Quality Network - EMQN) thiết kế, mỗi mẫu xét nghiệm thực hiện 2 phản ứng multiplex PCR với 8 cặp mồi để xác định 5 locus gen trên NST Y: 3 locus đặc hiệu trên nhánh dài là vùng AZFabc; 2 locus gen trên nhánh ngắn NST Y làm chứng nội tại: SRY và ZFY [155].
+ Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện 3 phản ứng multiplex PCR với 10 cặp mồi để xác định các locus gen trên NST Y. Trong đó có 8 cặp mồi xác định các locus gen đặc hiệu trên nhánh dài NST Y là vùng AZFabcd; 2 cặp mồi xác định các locus gen trên nhánh ngắn NST Y làm chứng nội tại là: SRY và ZFY.
Cặp mồi nhân đoạn đặc hiệu các vùng AZF lần lượt là AZFa: sY84- sY86; AZFb: sY127-sY134; AZFc: sY254-sY255; AZFd: sY152-BPY2.
Bảng 2.1. Các cặp mồi và trình t mồi dùng cho xét nghiệm mất đoạn AZFabcd Gen Trình t mồi Vị trí đoạn gen trên NST Y Kích thư c sản phẩm PCR sY84 F: 5′-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3′ R: 5′-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3′ AZFa/Yq 326 bp sY86 F: 5-GTGACACACAGACTATGCTTC-3′ R: 5′-ACACACAGAGGGACAACCCT-3 AZFa/Yq 320 bp sY127 F: 5′-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3′ R: 5′-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3′ AZFb/Yq 274 bp sY134 F: 5′-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3′ R: 5′-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3′ AZFb/Yq 301 bp sY254 F: 5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′ R: 5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′ AZFc/Yq 400 bp sY255 F: 5’- GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3’ R: 5’- CTCGTCATGTGCAGCCAC -3’ AZFc/Yq 126 bp sY152 F: 5'- AGACAGTCTGCCATGTTCA-3' R: 5 '- CAGGAGGTACTTAGCAGT-3' AZFd/Yq 125 bp BPY2 F: 5' - TAATTCCTCTTTACGCATGACC-3' R: 5'- ATATCTCTGAGCACATACC -3' AZFd/Yq 202 bp ZFY F: 5′- ACCRCTGTACTGACTGTGATTACAC-3′ R: 5′-GCACYTCTTTGGTATCYGAGAAAGT-3′ ZFY/Yp 495 bp SRY F: 5’ - A TAT TCC CGC TCT CG GA - 3’ R: 5’ - GGT GCT CCA TTC TG AG - 3’ TDF/Yp 472 bp
Bảng 2.2. Bảng thiết kế các phản ứng multiplex PCR trong xét nghiệm mất đoạn AZFabcd
Phản ứng multiplex PCR
Mồi Kích thư c sản
phẩm PCR Vị trí đoạn gen trên NST Y
Multiplex PCR1 (4 cặp mồi) SRY 472 bp TDF sY134 301 bp AZFb BPY2 202 bp AZFd sY152 125 bp AZFd Multiplex PCR2 (3 cặp mồi) ZFY 495 bp ZFY sY84 326 bp AZFa sY255 126 bp AZFc Multiplex PCR3 (4 cặp mồi) ZFY 495 bp ZFY sY254 400 bp AZFc sY86 320 bp AZFa sY127 274 bp AZFb Bảng 2.3. Các thành phần của phản ứng multiplex PCR Thành phần phản ứng Phản ứng 1 Phản ứng 2 Phản ứng 3 Mastermix PCR 6,25 µL 6,25 µL 6,25 µL Mồi (2,5 pmol/µL) SRY, sY134, BPY2, sY152 Mỗi cặp mồi (F: 0,1 µL, R: 0,1 µL)
ZFY, sY84, sY255 Mỗi cặp mồi (F: 0,1 µL, R: 0,1 µL) ZFY, sY86, sY127, sY254 Mỗi cặp mồi (F: 0,1 µL, R: 0,1 µL) ADN (30-45 ng/µL) 2 µL 2 µL 2 µL
Nư c Vừa đủ Vừa đủ Vừa đủ
Phản ứng được thực hiện trên máy PCR Mastercycler® ep Gradients - Eppendorf (Đức). Chu trình nhiệt như sau:
95oC - 10 phút, 34 chu kỳ
[94oC - 1 phút 10 giây, 56oC - 1 phút 30 giây, 72oC - 1 phút], 72oC- 10 phút,
Giữ lạnh 4oC.
- Trong mỗi phản ứng PCR, đều có sử dụng đối chứng âm, chứng nữ và chứng dương. Chứng dương: sử dụng ADN của người nam giới khỏe mạnh đã có con dưới 2 tuổi, tinh dịch đồ bình thường. Chứng âm: sử dụng ADN của người phụ nữ khỏe mạnh đã có con. Nếu không xuất hiện sản phẩm PCR tại vị trí nào đó, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR đơn mồi để khẳng định chắc chắn là có mất đoạn gen trên NST Y.
- Tiêu chuẩn đánh giá: các đoạn gen tương ứng phải được nhân lên với tất cả các mẫu chứng dương và không được nhân lên ở tất cả các chứng âm.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong TBE 1X với điện thế 100V trong 70 phút. Đánh giá kết quả theo thang ADN 100 bp của hãng Invitrogen, nhuộm bằng Ethidium Bromide để phát hiện kết quả.
2.2.3. Các bư c nghiên cứu
Sơ đồ 1.1. Sơ đồ tóm tắt các bư c th c hiện
2.2.4. Các chỉ số nghiên cứu
2.2.4.1. Một số đặc điểm về tuổi, nghề nghiệp, tiền sử bản thân và gia đình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Về độ tuổi, các đối tượng nghiên cứu được chia thành 5 nhóm tuổi: + 20-29 tuổi.
+ 30-39 tuổi. + 40-49 tuổi. + ≥ 50 tuổi.
Phương pháp nghiên cứu
(Nghiên cứu cắt ngang mô tả)
Nam giới vô sinh được lập bệnh án di truyền: thu thập thông tin tuổi, nghề nghiệp, địa chỉ, tiền sử bản thân, …
Khám cơ quan sinh dục ngoài Mô tả: * Mật độ, thể tích tinh hoàn * Các bất thường ở cơ quan sinh dục ngoài Xét nghiệm tinh dịch Đánh giá: * Chất lượng tinh dịch: Thể tích, pH, độ nhớt...tinh dịch * Chất lượng và số lượng tinh trùng * Dạng di chuyển của tinh trùng * Tốc độ di chuyển tinh trùng Xét nghiệm NST Phát hiện: * Bất thường NST thường + Số lượng, + Cấu trúc * Bất thường NST giới tính + Số lượng, + Cấu trúc Xét nghiệm ADN Phát hiện mất đoạn: AZFa AZFb AZFc AZFd Mất đoạn AZF kết hợp Phân tích thống kê Chương trình Excel và phần mềm SPSS Giá trị p, trung bình, mối tương quan …
Kết quả thống kê là để đánh giá tỷ lệ vô sinh hay gặp nhất ở nhóm tuổi nào.
- Nghề nghiệp: các đối tượng nghiên cứu được chia thành các nhóm: Lái xe, bộ đội, cán bộ viên chức, làm ruộng, công nhân, lao động tự do, kinh doanh, nghề khác. Kết quả thống kê nhằm đánh giá tỷ lệ vô sinh hay gặp nhất ở nhóm nghề nghiệp nào.
- Tiền sử của nam giới vô sinh được chia thành các nhóm: Quai bị, viêm tinh hoàn, GTMT, bệnh lý khác, tiếp xúc hóa chất hoặc không có tiền sử ảnh hưởng tới chất lượng tinh dịch.
2.2.4.2. Đặc điểm về thể tích và m t độ tinh hoàn
- Thể tích tinh hoàn được chia thành 6 nhóm: + ≤ 5 ml. + 6-10 ml. + 11-15 ml. + 16-20 ml. + 21-25 ml. + ≥ 26 ml.
- Mật độ tinh hoàn được chia làm 2 nhóm: Mật độ chắc, mềm.
2.2.4.3. Phân tích đặc điểm tinh dịch, tinh trùng và tốc độ di chuyển của tinh trùng của tinh trùng
- Đánh giá chất lượng tinh dịch dựa trên các chỉ số: Thể tích, pH, độ nhớt. - Đánh giá chất lượng tinh trùng dựa trên các chỉ số: Tỷ lệ tinh trùng di động, hình thái tinh trùng và tỷ lệ tinh trùng sống.
- Tốc độ di chuyển trung bình của tinh trùng: Chia thành các nhóm tinh trùng có tốc độ khác nhau:
+ ≤ 30 µm/s. + > 30-40 µm/s.
+ > 40-50 µm/s. + > 50 µm/s.
- Các loại tốc độ di chuyển của tinh trùng:
+ Tốc độ đường cong (VCL - Curvilinear velocity) (μm/s)
+ Tốc độ con đường trung vị (VAP - Average path velocity) (μm/s) + Tốc độ tuyến tính (VSL - Straight line velocity) (μm/s)
- Tính chất di chuyển của tinh trùng:
+ Tính tuyến tính (Linearity): LIN = VSL/VCL (%) + Tính tiến thẳng (Straightess): STR = VSL/VAP (%) + Tính dao động (Wobble): WOB = VAP/VCL (%)
- Chỉ số về các loại di động của tinh trùng được chia thành 4 mức độ: + Di động tiến tới nhanh (a) là di động > 25 µm/s.
+ Di động tiến tới chậm (b) là di động 5 - 25 µm/s.
+ Di động tại chỗ + không tiến tới (c) là di động < 5 µm/s và không di động nhưng có lúc lắc tại chỗ.
+ Không di dộng (d).
- Tỷ lệ di động tiến tới nhanh được chia thành các loại: + Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới nhanh ≥ 25%.
+ Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới nhanh < 25%.
2.2.4.4. Đặc điểm bộ NST
Đặc điểm NST được phân tích các chỉ số: - Về số lượng NST, phân tích các chỉ số: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lệch bội: Đánh giá là có lệch bội khi cụm NST có số lượng tăng hoặc giảm 1 hoặc 2 NST so với bộ lưỡng bội.
+ Đa bội là những cụm NST có số lượng 69 hoặc 92: trên thực tế khi phân tích không gặp hiện tượng đa bội ở các trường hợp nghiên cứu.
- Về cấu trúc NST, phân tích các chỉ số:
+ Chuyển đoạn NST: là hiện tượng một đoạn nào đó của NST không ở vị trí bình thường mà bị đứt ra rồi gắn vào một NST khác hoặc chuyển sang vị trí khác trên NST đó. Trong hiện tượng chuyển đoạn, phân thành 2 loại chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ là chuyển đoạn mà 2 NST khác nhau cùng bị đứt rồi trao đổi đoạn đứt cho nhau. Chuyển đoạn không tương hỗ là 1 đoạn của 1 NST bị đứt ra rồi chuyển sang một NST khác.
+ Đảo đoạn NST là hiện tượng một đoạn nào đó của NST đứt ra rồi quay đi một góc 180o
.
+ Nhân đoạn NST là hiện tượng một đoạn nào đó của NST tăng gấp đôi. + Mất đoạn NST: là hiện tượng một NST nào đó bị mất đi một đoạn. + NST marker (marker chromosome): là hiện tượng NST có kích thước rất nhỏ, bất thường cấu trúc NST chưa xác định được.
Các đột biến NST cả đột biến số lượng và cấu trúc nếu là thể thuần thì được phân tích tối thiểu 30 cụm NST. Nếu là thể khảm thì phân tích ít nhất 50 cụm NST (nếu tỷ lệ khảm cao), nếu tỷ lệ khảm thấp thì phân tích đến 100 cụm.
NST sau khi phân tích được phân thành các loại sau: