ứng hóa học
3.2.1.1. Định tính Glycosid tim
Cân 5g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vài ml chì acetat 30%, khuấy đều. Để lắng, lọc dịch vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm tiếp chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Sau đó, chuyển dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc dịch chiết với hỗn hợp cloroform - ethanol (4:1), lắc 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp dịch chiết cloroform trong ethanol vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natri sulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính:
Phản ứng của khung steroid (Phản ứng Liebermann – Bourchardat)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc
đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45o. Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ
(Phản ứng dương tính).
Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh Phản ứng Baljet:
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc
đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%). So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
Phản ứng Legal:
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc
đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim.
Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng (Phản ứng dương tính).
Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều
cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu đỏ tím (Phản
ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi có chứa glycosid tim.
3.2.1.2. Định tính Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt
Tiến hành: Cho 1g bột thân rễ Mồng tơi núi vào một ống nghiệm lớn. Thêm
10ml nước. Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
Kết quả: Cột bọt bền sau khi ngừng lắc 15 phút (Phản ứng dương tính).
Phản ứng Salkowski
Tiến hành: Cho 2g bột thân rễ Mồng tơi núi vào ống nghiệm lớn. Thêm 20ml
ethanol 90%. Đun sôi cách thủy 10 phút. Lọc lấy dịch lọc cho vào một ống nghiệm khác, để nghiêng ống nghiệm 45o, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1-2 giọt acid sulfuric đặc.
Kết quả: Xuất hiện vòng màu nâu đỏ ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng
(Phản ứng dương tính).
3.2.1.3. Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntraeger
Định tính Anthranoid dạng tự do:
Tiến hành: Cho 2g bột thân rễ Mồng tơi núi vào ống nghiệm lớn (10ml). Thêm
10ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua một lớp bông mỏng vào bình gạn dung tích 50ml. Để nguội dịch lọc. Thêm 5ml cloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp cloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
Kết quả: Lớp nước không chuyển sang màu đỏ sim (Phản ứng âm tính).
Định tính Anthranoid dạng toàn phần:
Tiến hành: Cho 2g bột thân rễ Mồng tơi núi vào ống nghiệm lớn. Thêm 5ml
dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như ở trên.
Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ.
Kết quả: Lớp nước không chuyển sang màu đỏ sim (Phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa
Tiến hành: Trải bột thân rễ Mồng tơi núi thành lớp mỏng trong một nắp chai
bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước. Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5- 10 phút. Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi.
Kết quả: Không xuất hiện tinh thể trên lam kính (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi không chứa anthranoid.
3.2.1. 4. Định tính Tanin
Tiến hành: Cho 2g bột thân rễ Mồng tơi núi vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml
nước cất. Đun sôi trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem làm các phản ứng định tính.
Phản ứng với protein
Ống 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1% mới pha.
Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng âm tính).
Phản ứng với ion kim loại nặng
Ống 2: Thêm vào vài giọt FeCl3 5%.
Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa xanh đen (Phản ứng âm tính).
Ống 3: Thêm vào vài giọt chì acetat 10%.
Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện kết tủa bông (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi không có chứa tanin.
3.2.1. 5. Định tính đường khử
Tiến hành: Cân khoảng 2g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào ống nghiệm lớn,
thêm 10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm 1ml dung dịch thuốc thử Fehling A và 1ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy sôi vài phút.
Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa đỏ gạch (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi không có đường khử.
3.2.1. 6. Định tính Polysaccharid
Tiến hành: Lấy 2g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào ống nghiệm lớn, thêm
10ml nước cất. Đun sôi cách thủy vài phút. Lọc lấy dịch. Cho vào 2 ống nghiệm: Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol.
Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol.
Kết quả: Màu ống 1 xanh đậm hơn màu ống 2 nhiều (Phản ứng dương tính
mạnh).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi có chứa polysaccharid.
3.2.1. 7. Định tính Acid amin
Tiến hành: Lấy 2g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào ống nghiệm lớn, thêm
10ml nước cất, đun sôi vài phút. Lọc qua giấy lọc vào 1 ống nghiệm khác. Thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi vài phút.
Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện màu xanh rất nhanh và nhiều (Phản ứng dương tính mạnh).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi có acid amin.
3.2.1.8. Định tính Acid hữu cơ
Tiến hành: Cho 2g bột thân rễ Mồng tơi núi vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml
nước cất. Đun sôi trực tiếp vài phút trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội và lọc. Thêm vào dịch lọc một ít bột Na2CO3.
Kết quả: Ống nghiệm xuất hiện bọt khí bay lên (Phản ứng dương tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi có chứa acid hữu cơ.
3.2.1.9. Định tính Flavonoid
Lấy 2g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesi
kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên vài phút.
Kết quả: Dung dịch có hiện tượng sủi bọt và không bị chuyển màu (Phản ứng
âm tính).
Phản ứng với kiềm
Bước 1: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Thêm 1ml nước cất.
Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện tủa vàng (Phản ứng âm tính).
Bước 2: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút. Nhỏ một giọt khác lên giấy lọc để so sánh.
Kết quả: Màu vàng của vết dịch chiết không thay đổi (Phản ứng âm tính).
Phản ứng với FeCl3
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vài giọt dung dịch
FeCl3 5%.
Phản ứng diazo hóa
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch
kiềm (dung dịch NaOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút.
Kết quả: Dung dịch màu vàng, không đổi sang màu đỏ (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi không có chứa flavonoid.
3.2.1.10. Định tính Coumarin
Lấy 2g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 20ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng định tính.
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát
Kết quả: Ống 1 có tủa vàng. Ống 2 trong.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát
Kết quả: Ống 1 trong. Ống 2 đục.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, quan sát
Kết quả: Ống 1 đục. Ống 2 trong (Phản ứng dương tính).
Phản ứng diazo hóa
Tiến hành: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 2ml dung dịch
NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vào giọt thuốc thử diazo.
Kết quả: Dung dịch màu vàng, không đổi màu (Phản ứng âm tính).
Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)
Tiến hành: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch
miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại.
Kết quả: Phần không bị che có huỳnh quang không sáng hơn phần bị che
(Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi không chứa coumarin.
3.2.1.11. Định tính Alkaloid
Cân 5g bột thân rễ Mồng tơi núi, cho vào bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dung dịch amoniac đặc. Đậy kín để khoảng 30 phút. Cho 15ml cloroform lắc đều trong 1giờ. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dung dịch H2SO4 1N. Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Ống 1: thuốc thử Mayer.
Kết quả: Không xuất hiện kết tủa trắng (Phản ứng âm tính).
Ống 2: thuốc thử Bouchardat.
Kết quả: Không xuất hiện kết tủa nâu (Phản ứng âm tính).
Ống 3: thuốc thử Dragendorff.
Kết quả: Không xuất hiện kết tủa đỏ cam (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi không chứa alkaloid.
3.2.1.12. Định tính chất béo, steroid, caroten
Lấy 5g bột thân rễ Mồng tơi núi vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, bọc kín, ngâm 24 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Chia dịch lọc làm 3 phần để tiến hành định tính.
Định tính chất béo
Tiến hành: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc trắng, sấy nhẹ cho bay hết
hơi dung môi.
Định tính Steroid
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn.
Thêm vào ống nghiệm khoảng 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để nghiêm ống nghiệm 45o, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng
phía trên có màu xanh lá (Phản ứng dương tính).
Định tính Caroten
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, cô cách thủy đến cắn, nhỏ
vài giọt H2SO4 đặc vào cắn.
Kết quả: dung dịch không chuyển sang màu xanh lá (Phản ứng âm tính).
Kết luận sơ bộ: Trong thân rễ Mồng tơi núi chứa steroid, không chứa chất béo
và caroten.
Kết quả các phản ứng định tính được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong thân rễ Mồng tơi núi
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Glycosid tim - P.Ư Liebermann - P.Ư Legal - P.Ư Baljet + + + Có 2 Saponin - H.T tạo bọt - P.Ư Salkowski + + Có
3 Anthranoid - P.Ư Borntrager - Vi thăng hoa
-
- Không có
4
Tanin
- P.Ư với Gelatin 1% - P.Ư với Chì acetat 10% - P.Ư với FeCl3 5%
- + -
Không có
5 Đường khử - P.Ư với TT Fehling A, B - Không có
Chú thích: (-): Phản ứng âm tính ; (++): Phản ứng dương tính rõ (+): Phản ứng dương tính; (+++): Phản ứng dương tính mạnh.
Nhận xét: So sánh kết quả định tính sơ bộ với kết quả của các nghiên cứu khác
nhận ta thấy:
- Trong mẫu nguyên liệu thân rễ Mồng tơi núi thu hái tại Hà Nội có chứa các chất: saponin, glycosid tim, acid amin, polysaccharid, steroid và acid hữu cơ.
- Theo các nghiên cứu trước đây trên thế giới, trong thân rễ cây Mồng tơi núi
[Anredera cordifolia (Ten.) Steenis] có chứa các thành phần: glycosid tim, saponin
triterpenoid, alkaloid, flavonoid, acid amin, polysaccharid [10], [11] trong khi mẫu nghiên cứu không phát hiện thấy alkaloid và flavonoid. Sự khác nhau giữa các kết quả có thể do mẫu thu hái ở các vùng khác nhau do khí hậu, đất trồng khác nhau hoặc do thời điểm thu mẫu khác nhau.
7 Acid amin - P.Ư với TT Ninhydrin 3% +++ Có
8 Acid hữu cơ - Na2CO3 + Có
9
Flavonoid
- P.Ư Cyanidin - P.Ư với kiềm - P.Ư với FeCl3 - P.Ư với TT Diazo
- - - - Không có 10 Coumarin - P.Ư đóng mở vòng Lacton - P.Ư với TT Diazo
- Huỳnh quang + - - Không có 11 Alkaloid
- P.Ư với TT Mayer - P.Ư với TT Dragendorff - P.Ư với TT Bouchardat
- - -
Không có
12 Chất béo - Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc - Không có
13 Steroid - P.Ư Liebermann + Có