3.2.2.1. Chuẩn bị dịch chiết
Cân chính xác khoảng 5,0g bột thân rễ Mồng tơi núi cho vào bình nón 50ml. Thêm khoảng 20ml Methanol. Ngâm lạnh 1 ngày. Sau đó lọc. Đem cô cách thủy tới khi thu được dịch để chấm sắc ký.
3.2.2.2. Tiến hành và kết quả
Tiến hành: Chấm dịch chiết trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254 đã hoạt
hóa ở 110oC trong 1 giờ (sử dụng mao quản chấm sắc kí hoặc sử dụng bơm tiêm mẫu của hệ thống sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao). Dung môi khai triển được bão hòa, khai triển theo chiều từ dưới lên trên. Tiến hành dò các hệ dung môi để chọn ra hệ phù hợp nhất. Sau khi triển khai, quan sát dưới ánh sáng thường, dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm, sau đó phun thuốc thử hiện màu Vanilin/H2SO4 đặc (Hòa tan 0,5g vanilin trong 20ml Ethanol 96o để được dung dịch bão hòa, lấy phần dung dịch bão hòa, nhỏ từ từ khoảng 2ml acid sulfuric đặc đến khi có ánh vàng, pha ngay trước khi sử dụng). Hơ nhiệt khoảng 1-2 phút ở 110oC (hoặc sử dụng máy sấy ở nhiệt độ cao) đến khi hiện màu rõ nét, quan sát dưới ánh sáng thường. Chụp lại bằng máy ảnh kỹ thuật số.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng máy chấm sắc kí Linomat 5 để đưa dịch chiết lên bản mỏng. Sau khi triển khai, chụp ảnh bằng hệ thống Camag Reprostar 3. Kết quả được xử lý, đánh giá bằng phần mềm WinCATS và VideoScan.
Sử dụng dịch chấm sắc ký, tiến hành thăm dò trên nhiều hệ dung môi khác nhau.
Hệ I: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1)
Hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1) Hệ III: Cloroform - Methanol (9:1)
Hệ IV: Cloroform - Ethyl acetat (5:1)
Kết quả: Sau nhiều lần triển khai sắc ký cho thấy, hệ I và II cho kết quả tách
Hình 3.10. Sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Mồng tơi núi trong MeOH triển khai hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1)
IIa. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm.
IIb. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm.
IIc. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử.
Hình 3.9. Sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Mồng tơi núi trong MeOH triển khai hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1)
Ia. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 254nm.
Ib. Sắc ký đồ dịch chiết ở bước sóng 366nm.
Ic. Sắc ký đồ dịch chiết ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử.
Hình ảnh sắc ký đồ hệ II được đưa đi xử lý bởi phần mềm WinCATS có định dạng *. cna được chuyển sang phần mềm VideoScan dưới định dạng *. cpf, xử lý và phân tích thu được đồ thị, bảng biểu diễn kết quả phân tích sắc ký đồ. Kết quả được thể hiện ở hình dưới đây:
Hình 3.11. Đồ thị, bảng biểu diễn kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Mồng tơi núi trong MeOH khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1) ở bước sóng 254nm
Hình 3.12. Đồ thị, bảng biểu diễn kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Mồng tơi núi trong MeOH khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1) ở bước sóng 366nm
Hình 3.13. Đồ thị, bảng biểu diễn kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Mồng tơi núi trong MeOH khi triển khai ở hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1) ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử.
Nhận xét: Khi soi ở bước sóng UV 366nm, do saponin bắt huỳnh quang kém
nên độ sáng cũng như độ đậm của vết kéo lên nhạt hơn các tạp chưa được kéo lên ở dưới chân dải sắc ký.
Sau khi phân tích sắc ký đồ hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1), ta có kết quả thu được như sau:
- Tại bước sóng UV 254nm phát hiện 8 vết, trong đó vết số 3 có Rf = 0,57 đậm nhất.
- Tại bước sóng UV 366nm phát hiện 15 vết có huỳnh quang, trong đó vết số 8 có Rf = 0,57 có cường độ huỳnh quanh mạnh nhất.
- Sau khi phun TT: Tại sánh sáng thường phát hiện được 11 vết, trong đó vết số 7 có Rf = 0,72 là vết tách rõ và chiềm lượng chất nhiều nhất.
3.3. BÀN LUẬN
3.3.1. Về phương pháp nghiên cứu
Đề tài đã sử dụng những phương pháp thường quy tiến hành nghiên cứu cơ bản về đặc điểm hình thái, vi phẫu, bột dược liệu, định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ của dược liệu.
Sử dụng máy chấm sắc ký Linomat 5 để đưa dịch chiết lên bản mỏng. Sau khi triển khai, chụp ảnh bằng buồng chụp Camag Reprostar 3, xử lý và phân tích sắc ký đồ bằng phần mềm WinCATS và VideoScan nên kết quả thu được khá chính xác và rõ ràng. Các thông số thu được rất hữu ích cho việc định tính và bán định lượng thành phần hóa học trong dịch chiết, đóng góp cơ sở dữ liệu cho công tác kiểm nghiệm sau này.
3.3.2. Về kết quả nghiên cứu3.3.2.1. Đặc điểm thực vật 3.3.2.1. Đặc điểm thực vật
Về đặc điểm hình thái thực vật: So sánh được những đặc điểm quan sát được trên mẫu Mồng tơi núi thu hái được với mô tả trong các tài liệu và hình ảnh mẫu cây và hoa khô do Cử nhân Ngô Văn Trại của Viện Dược giám định tên khoa học trong các phụ lục (1,2,3,4) hầu hết khớp với các mô tả trong tài liệu.Từ đó cho thấy cây Mồng tơi núi có tên khoa học Anredera cordifolia (Ten.) Steenis, mang những
đặc điểm đặc trưng của chi Anredera: dây leo; thân tròn, nhẵn; lá đơn, mọc cách, hình tim, dày, có cuống; thân rễ mọc ở nách lá và ở dưới rễ…
Về đặc điểm vi học: Những mô tả về đặc điểm vi phẫu (lá, thân, thân rễ) và đặc điểm bột của mẫu Mồng tơi núi là những kết quả bước đầu xây dựng lý lịch mẫu để định hướng cho việc kiểm nghiệm dược liệu Mồng tơi núi trong các nghiên cứu sau này.
3.3.2.2. Thành phần hóa học
Các phản ứng định tính dịch chiết Mồng tơi núi đã được tiến hành để xác định sơ bộ các nhóm chất có trong dược liệu.
Dịch chiết MeOH toàn phần thân rễ Mồng tơi núi được dùng để triển khai SKLM. Sau khi triển khai trên nhiều hệ dung môi, tìm được 2 hệ dung môi tách rõ nhất là: hệ I: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1) và hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1), 2 hệ sắc kí này đã được triển khai lại nhiều lần và cho kết quả lặp lại giống nhau nên kết quả đáng tin cậy. Dựa vào kết quả sắc ký đồ sau khi xử lý bằng phần mềm VideoScan có thể định hướng cho việc kiểm nghiệm, phân biệt các loại Mồng tơi trong chi Anredera nói riêng cũng như trong họ Mồng tơi (Basellaceae) nói chung.
Đề tài nghiên cứu về dược liệu Mồng tơi núi là một trong những đề tài mới. Những kết quả nghiên cứu trên đây chỉ là bước đầu góp phần định hướng cho nhiều nghiên cứu sâu hơn về Mồng tơi núi – Anredera cordifolia (Ten.) Steenis ở Việt Nam nhằm đưa Mồng tơi núi vào sử dụng cũng như bổ sung thêm tư liệu vào kho tàng cây thuốc sử dụng trong Y học dân tộc.
3 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1. KẾT LUẬN
Sau quá trình thực hiện, đề tài đã thu được một số kết quả như sau:
4.1.1. Về thực vật
- Xác định được “Mồng tơi núi” là 1 loài thuộc chi Anredera (họ Basellaceae) có tên khoa học là Anredera cordifolia (Ten.) Steenis.
- Đã mô tả được đặc điểm hình thái thực vật, mô tả chi tiết và chụp ảnh vi phẫu và ảnh đặc điểm bột lá, thân, thân rễ cây Mồng tơi núi.
4.1.2. Về mặt hóa học
- Bằng các phản ứng định tính sơ bộ đã xác định trong thân rễ Mồng tơi núi nghiên cứu có chứa: saponin, glycosid tim, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, steroid. Trong đó, acid amin và polysaccharid chiếm tỷ lệ lớn nhất.
- Triển khai sắc ký lớp mỏng dịch chiết MeOH thân rễ Mồng tơi núi trên nhiều hệ dung môi cho kết quả tách tốt ở các hệ:
Hệ I: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (5:4:1)
Hệ II: Toluen - Ethyl acetat - Acid formic - Methanol (4:4:0,5:1)
Sau đó đã phân tích sắc ký đồ bằng các phần mềm WinCATS và VideoScan, tính ra được số vết cũng như giá trị Rf của các vết.
Đây là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Mồng tơi núi khi đưa vào sử dụng, đồng thời tạo lý lịch mẫu để bổ sung thêm các tư liệu, bổ sung vào kho tàng cây thuốc sử dụng trong Y học dân tộc.
4.2. ĐỀ XUẤT
Từ những kết quả thu được, đề tài có một số đề xuất như sau:
- Nghiên cứu hình thức sử dụng hợp lý “Mồng tơi núi” để nâng cao giá trị thực tiễn của loại cây này, bổ sung vào kho tàng cây thuốc sử dụng trong Y học dân tộc.
- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu khi đưa vào sản xuất. Đồng thời, nghiên cứu thêm về tác dụng dược lý của dược liệu Mồng tơi núi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt
kín (Magnoliophyta, Angiospermae) ở Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội,
tr. 17,100,108,124.
2. Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội (2013), Thực tập Dược
Liệu - Phần Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, tài liệu lưu
hành nội bộ, Hà Nội, tr. 14 - 48.
3. Bộ môn dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội (2013), Thực tập Dược
liệu - Phần kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học, tài liệu lưu
hành nội bộ, Hà Nội, tr. 59 - 88.
4. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2011), Dược liệu học tập I, Nxb Y học, Hà Nội.
5. Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Dược Liệu học
tập II, Nxb Y học, Hà Nội.
6. Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Y Dược TP HCM (9/2012), Phương
pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, tr. 28 - 35.
7. Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội (2012), Thực tập Thực vật
và nhận biết cây thuốc, Trung tâm thông tin - Thư viện trường đại học Dược
HN, Hà Nội.
8. Võ Văn Chi (2013), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), Nxb Y học, tr. 143-145.
9. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nxb Y học, Hà Nội.
10. Nguyễn Viết Thân (2013), Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường dùng, Nxb Thế giới, tr. 54.
TIẾNG ANH
11. Astuti Sri Murni, Mimi Sakinah AM, Andayani Retno, Risch Awalludin (2011), "Determination of Saponin Compound from Anredera cordifolia
(Ten) Steenis Plant (Binahong) to Potential Treatment for Several Diseases",
Journal of Agricultural Science, 3(4).
12. Bown Deni (1995), The Royal Horticultural Society encyclopedia of herbs &
their uses, Dorling Kindersley Limited.
13. Calzada Fernando, Mata Rachel, Bye Robert, Linares Edelmira (1990), "A retrochalcone from Anredera scandens", Phytochemistry, 29(8), pp. 2737- 2738.
14. Chuang Mao-Te, Lin Yin-Shiou, Hou Wen-Chi (2007), "Ancordin, the major rhizome protein of madeira-vine, with trypsin inhibitory and stimulatory activities in nitric oxide productions", Peptides, 28(6), pp. 1311-1316.
15. E. Y. Sukandar I. Fidrianny and L. F. Adiwibowo (2011), "Eficacy of Ethanol Extract of Anredera cordifolia (Ten,) Steenis Leaves on Improving Kidney Failure in Rats", International Journal of Pharmacology 7(8), pp. 850 - 855.
16. Eriksson Roger (2007), "A Synopsis of Basellaceae", Kew Bulletin, 62(2), pp. 297 - 320.
17. Gabrielle Vivian-SmithA Ben E. LawsonB, Ian Turnbull Cand Paul O. DowneyD (2007), "The biology of Australian weeds", Plant Protection
Quarterly, 22(1), pp. 2 - 10.
18. Harborne Jeffrey B (1984), Phytochemical methods, Springer. 19. Flora of China (2003), vol.5, pp. 445-446.
20. Son Kun Ho, Do Jae Chul, Kang Sam Sik (1990), "Steroidal saponins from the rhizomes of Polygonatum sibiricum", Journal of natural products, 53(2), pp. 333-339.
21. Starr Forest, Starr Kim, Loope Lloyd (2003), Anredera cordifolia, United States Geological Survey--Biological Resources Division Haleakala Field Station, Maui, Hawai.
22. Sukandar EY, Fidrianny I, Adiwibowo LF (2011), "Efficacy of Ethanol Extract of Anredera cordifolia (Ten) Steenis Leaves on Improving Kidney Failure in Rats", International Journal of Pharmacology, 7(8).
TIẾNG PHÁP
23. Lecomte H (1910), Flore Générale de l’Indochine Stom V, Pari, pp. 9.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Tiêu bản khô Anredera cordifolia (Ten.) Steenis do cử nhân Ngô Văn Trại thu hái tại xã Mường Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An, giám định ngày 27/10/2004 và được lưu tại Viện Dược Liệu.
Phụ lục 2: Tiêu bản khô Anredera cordifolia (Ten.) Steenis do cử nhân Ngô Văn Trại thu hái tại Nậm Cắn, Kỳ Sơn, Nghệ An, giám định ngày 27/10/2004 và được lưu tại Viện Dược Liệu.
Phụ lục 3: Tiêu bản hoa khô Anredera cordifolia (Ten.) Steenis do cử nhân Ngô Văn Trại thu hái tại xã Nậm Cắn, Kỳ Sơn, Nghệ An giám định ngày 1/11/2004 và được lưu tại Viện Dược Liệu.
Phụ lục 4: Tiêu bản khô Anredera cordifolia (Ten.) Steenis do Cử nhân Ngô Văn Trại thu hái tại Đồng Văn, Hà Giang, được giám định ngày 21/12/1999 và được lưu tại Viện Dược Liệu.