2.6.1. Kĩ thuật tách [9]
Hiện nay có rất nhiều kĩ thuật tách áp dụng trong quy trình định lƣợng thuốc trong dịch sinh học. Kĩ thuật có nhiều ƣu điểm nhất là điện di mao quản. Bên c nh đó còn có nhiều kĩ thuật khác dựa trên nguyên tắc sắc kí bao gồm sắc kí khí và sắc kí lỏng.
Điện di dựa vào sự di chuyển của các h t tích điện dƣới tác dụng của điện trƣ ng. Quá trình tách phụ thuộc vào tốc độ di chuyển khác nhau của các chất tan. Khi có một điện trƣ ng ngoài tác động lên dung dịch có h t tích điện, mỗi ion sẽ di chuyển theo về phía điện cực đối diện. Tốc độ di chuyển của mỗi lo i h t tùy thuộc vào bản chất môi trƣ ng, kích thƣớc h t và cƣ ng độ điện trƣ ng.
Trong sắc kí khí, mẫu đƣợc làm bay hơi và tiêm vào cột phân tích. Mẫu sau khi tiêm đƣợc di chuyển qua cột bằng dòng khí trơ ho t động nhƣ một pha động. Các khí mang thƣ ng dùng là nitrogen, argon carbon dioxid và helium. Cột thƣ ng đƣợc tráng bằng pha tĩnh lỏng. Nhiệt độ cột phụ thuộc vào điểm sôi của mẫu đƣợc bay hơi. Có nhiều lo i bộ phận phát hiện (detector) sử dụng trong sắc kí khí gồm có detector ion hóa ngọn lửa, ngọn lửa trắc quang, bắt điện tử và dẫn nhiệt. Mỗi lo i detector phù hợp cho từng điều kiện tách các lo i mẫu khác nhau.
Kĩ thuật tách thƣ ng đƣợc sử dụng nhất trong phân tích dịch sinh học là sắc kí lỏng (LC). LC, hay còn gọi là sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), là một quá trình phân tích, phân tách từng thành phần trong một hỗn hợp và thƣ ng sử dụng cho cả định tính và định lƣợng. Thành phần cơ bản của bất kì một hệ thống LC nào cũng bao gồm: bơm/ hệ thống cung cấp dung môi, bơm tiêm, cột phân tích (pha tĩnh), bộ phận phát hiện (detector) và máy tính (PC). Pha động chứa mẫu đƣợc bơm vào hệ thống và tƣơng tác với pha tĩnh-phần quan trọng nhất của hệ thống. Cột với pha tĩnh bên trong là nơi quá trình phân tách xảy ra ở đây. Các thành phần sau khi đƣợc tách ra sẽ đi đến detector trƣớc khi chảy ra ngoài ho c đƣợc thu l i. Đối với hệ thống HPLC cũng có nhiều lo i
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
detector khác nhau nhƣ detector UV-Vis, huỳnh quang, dãy diod quang (PDA) và khổi phổ (MS).
Hình 2.10 Sơ đồ đơn giản hệ thống HPLC
2.6.2. Kĩ thuật chi t[9]
Trƣớc khi đƣa mẫu sinh học vào phân tích bằng hệ thống HPLC, mẫu phải đƣợc xử lý và làm s ch. Lƣợng thuốc trong mẫu phải đƣợc chiết ra với độ phục hồi cao nhất có thể. Có nhiều kĩ thuật chiết đƣợc áp dụng cho các mẫu sinh học nhƣ tủa protein (PP), chiết lỏng – lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE).
2.6.2.1. PP[9]
PP là một kĩ thuật chiết khá tốt trong đó một dung môi hay acid ho c base m nh đƣợc thêm vào mẫu sinh học để tủa protein dƣới d ng h t nhỏ, sau đó đem ly tâm, dịch nổi chứa chất cần phân tích đƣợc thu l i và đem đi phân tích. Độ tan của protein trong
Buồng tiêm mẫu
Bộ phận phát hiện Máy tính Thu hồi Cột sắc kí Dung môi Bơm
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
dung dịch đệm phụ thuộc vào bản chất của acid amin phân cực hay không phân cực cấu thành nên protein. Những protein có tỷ lệ acid amin kị nƣớc cao trên bề m t sẽ không thể hòa tan trong nƣớc. Giữa các protein có lực hút hay đẩy tĩnh điện phụ thuộc vào bản chất môi trƣ ng chứa chúng. PP xảy ra bằng cách thêm vào một tác nhân tủa (nhƣ h t gel trong kĩ thuật lọc gel) vào dịch chứa protein. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là dịch chiết vẫn còn chứa nhiều thành phần phức t p và dịch nổi vẫn có nguy cơ bị tủa.
2.6.2.2. LLE [9]
LLE là phƣơng pháp chiết dựa vào sự hòa trộn của hai chất lỏng không đồng tan. Sự phân tán lỏng lỏng đƣợc t o ra bằng quá trình trộn đƣợc tách ra bằng trọng lực ho c bằng lực ly tâm sau đó. Đối với mẫu sinh học thƣ ng một dung môi hữu cơ đƣợc thêm vào và trộn lên. Thuốc cần chiết di chuyển từ pha nƣớc vào pha hữu cơ có độ hòa tan tốt hơn, không kèm protein và lipid. Một nhƣợc điểm lớn của LLE là khó tự động hóa và lƣợng dung môi hữu cơ tiêu tốn khá lớn. LLE thƣ ng đòi hỏi kèm theo quá trình bốc hơi đến khô và phục hồi mẫu.
Hình 2.11 Các bƣớc chính trong quá trình chiết lỏng – lỏng
Dịch nƣớc
Dung môi hữu cơ
Thêm vào pha hữu cơ s ch Trộn để các phân tử phân vùng Các pha đƣợc ổn địch và chia tách bằng trọng lực
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
2.6.2.3. SPE [9]
SPE – một trong những kĩ thuật chiết phổ biến và rẻ nhất – sử dụng một pha rắn và một pha lỏng để phân tách chất trong mẫu sinh học. Quá trình chiết SPE tổng quát bao gồm 4 bƣớc: ổn định cột, đƣa mẫu lên cột, rửa cột và rửa giải chất phân tích. Hộp hay đĩa SPE đƣợc điều hòa với dung môi (làm ẩm) sau đó mẫu đƣợc đƣa lên cột và cho ch y qua cột. Nếu pha tĩnh đƣợc chọn chính xác, chất phân tích đƣợc giữ l i trên cột trong khi phần thừa dịch sinh học sẽ đƣợc thải ra ngoài. Một dung môi có ái lực với chất phân tích đƣợc cho vào và ch y qua cột để rửa giải chất phân tích với thể tích nhỏ nhất có thể. Một ƣu điểm lớn của SPE là có thể tự động hóa với th i gian tối ƣu và công suất tăng.
Hình 2.12 Các bƣớc chính trong quá trình chiết rắn SPE
Bƣớc 1 Bƣớc 2 Bƣớc 3 Bƣớc 4
Điều kiện hóa Thêm mẫu Rửa cột Rửa giải
Các chất ảnh hƣởng trong dịch rửa giải
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Thỏ cái khỏe m nh, n ng từ 2-2,5 kg, chƣa qua thử nghiệm. Thỏ mua về đƣợc nuôi trong môi trƣ ng thử nghiệm 1 tuần trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.
3.2.HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ NGHIỆM 3.2.1. Thuốc thử 3.2.1. Thuốc thử
PTX 6 mg/ml đƣợc bào chế ở d ng dung dịch, lọ 30 mg/5 ml t i Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh dƣới sự phối hợp nghiên cứu của bộ môn Hóa Dƣợc, bộ môn Công Nghiệp Dƣợc, khoa Dƣợc ĐH Dƣợc Tp.HCM và Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM. Thuốc đ t tiêu chuẩn dƣợc điển Mỹ - USP 35.
Thành phần công thức 1 Thành phần công thức 2 Paclitaxel Acid citric Cremophor EL Ethanol khan Paclitaxel Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin Polyvinyl pyrolidon K30 (PVP K30) PEG 400 Tween khan Nƣớc cất pha tiêm 3.2.2. Thuốc đối chứng
PTX Stragen®6 mg/ml d ng đóng gói 30 mg/5 ml, số lô X070, số đăng kí VN1 – 423 – 11, h n dùng 10.2014, do công ty Haupt pharma Wolfratshausen GmbH (Pfaffenriederer Strabe 5, D-82515 Wolfratshausen, Germany) sản xuất.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Nƣớc muối sinh lý dùng để pha tiêm: natri chlorid (NaCl) 0,9 %, chai 500 ml, số lô 13178PN, số đăng kí VD – 10634 – 10, ngày sản xuất 13/05/13, h n dùng 13/05/16, do công ty Mekophar Chemical Pharmaceutical Joint-Stock (297/5 Lý Thƣ ng Kiệt, quận 11, TP HCM, Việt Nam) sản xuất.
3.2.3. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Ống ly tâm bằng thủy tinh thể tích 12 ml.
Dung dịch EDTA 1% để tráng kim tiêm trƣớc khi lấy máu.
Methanol (HPLC) (Merk), acetonitril (HPLC)(Merk), diethyl ether (HPLC) (Merk), nƣớc cất, KH2PO4 d ng rắn và amoniacetat để pha dung dịch đệm có t i Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM.
Máy thổi nitơ có điều nhiệt.
Máy ly tâm thƣ ng MRC (Israel) và ly tâm l nh MICRO 220R (Germany). Máy điều chỉnh pH.
Máy vortex IKA ms3 (Germany).
Micropipette thể tích 20-200 ml, 10-1000 ml.
Hệ thống HPLC Shimadzu với detector PDA, cột sắc kí phenomenax Gemini C-18, 250 x 4,60 mm – 5 microns.
Các dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm: ống ly tâm bằng thủy tinh, bình định mức, bình nón, pipet thƣ ng và pipet chính xác, cốc có mỏ, …
3.3.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phƣơng pháp thẩm định qui trình định lƣợng pacitaxel trong huyết tƣơng thỏ bằng HPLC.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
3.3.1. Pha mẫu chuẩn
Pha chuẩn PTX (PTX) 500 µg/ml và nội chuẩn (IS) carbamazepin (CAR) 500 µg/ml trong methnol, bảo quản ở 4 oC. Dùng dung dịch chuẩn PTX pha thành các dung dịch với nồng độ 50-25-12,5-5 và 2,5 µg/ml. Những dung dịch này đƣợc dùng để t o mẫu tự t o trong huyết tƣơng để thẩm định quy trình trong 3 ngày liên tiếp. Nội chuẩn đƣợc pha thành nồng độ 20 µg/ml. Mẫu để xây dựng đƣ ng chuẩn đƣợc chuẩn bị trong 400 µl huyết tƣơng trắng với các nồng độ thuốc thích hợp vào ngày thẩm định. Mẫu để thẩm định độ đúng, độ chính xác và tỷ lệ phục hồi đƣợc chuẩn bị trong huyết tƣơng với các nồng độ 0,5-1-2,5-50 µg/ml, bảo quản ở -20 oC.
3.3.2. Phƣơng pháp chi t
Thêm vào 0,5 ml huyết tƣơng 100 µl dung dịch chuẩn nội (IS) carbamazepin 20 µg/ml, 0,2 ml đệm ammonium acetat 0,2M-pH 5,0 và 4 ml ether. Trộn kĩ trong 5 phút và ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Hút lấy 3,5 ml dịch hữu cơ chuyển vào ống s ch, bốc hơi dung môi bằng hơi nitơ ở 40o
C. Hòa tan mẫu trong 0,5 ml pha động (acetonitril / methanol / 2mM đệm phosphate pH 5,0) (42/22/36 v/v), ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút trong máy ly tâm l nh ở -10 o
C, hút dịch, lọc qua màng lọc milipore 0,45 µm trƣớc khi sắc kí.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Hình 3.1 Sơ đồ chiết PTX trong huyết tƣơng
Mẫu xây dựng đƣ ng chuẩn đƣợc chuẩn bị ở các nồng độ trong vùng từ 0,5 – 50 µg/ml.
3.3.3. Điều kiện sắc kí
Đầu dò PDA, bƣớc sóng phát hiện 227 nm.
Cột phenomenax Gemini C-18, 250 x 4,60 mm – 5 microns.
Pha động: acetonitril / methanol / 2mM đệm phosphate pH 5,0 (42 / 22 / 36 v/v/v). Chƣơng trình ch y: đ ng dòng 100 ml IS 20 µg/ml Đệm + 0,5 ml pha động, lắc, ly tâm Bốc hơi nito, 40 oC Cắn khô Dịch Dịch ch y sắc kí Lắc 5 phút, ly tâm 5 phút-tốc độ 4000 rpm Dịch ether 0,5 ml huyết tƣơng 4 ml ether Lọc qua màng 0,45 µm
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút Thể tích bơm mẫu: 20 µl
Th i gian lƣu: PTX: 7,0 phút; IS: 3,8 phút Th i gian cài đ t: 17 phút
Nhiệt độ buồng mẫu: 15 oC Nhiệt độ buồng cột: 30 oC
3.3.4. Định lƣợng palitaxel trong huy t tƣơng thỏ
PTX đƣợc pha trong dung dịch NaCl 0,9% thành dung dịch có nồng độ 1 mg/ml, liều tiêm cho thỏ đƣợc thăm dò trên 2 liều: 3 mg/kg và 6 mg/kg.
3.3.5. Quy trình
Thỏ đƣợc cố đinh trong khung cố định. Dùng gòn tẩm cồn để sát trùng vị trí tiêm trên vành tai thỏ. Dung dịch PTX đƣợc tiêm tĩnh m ch nhanh liều duy nhất vào tĩnh m ch vành tai vào th i điểm 7h sáng mỗi ngày. Sau khi tiêm thuốc, th i điểm lấy máu là 5- 10-15-20-30-45-60-90-120-150-180-240-300-360 phút sau khi tiêm. Các mẫu máu đƣợc lấy ở tĩnh m ch vành tai phía đối diện và chứa trong ống chứa EDTA do công ty Nam Khoa cung cấp.
Trƣớc khi lấy máu, tráng kim tiêm với complexon III 1% để tránh đông máu trong kim. Thể tích máu lấy cho mỗi mẫu tối thiểu là 1,2 ml. Mẫu máu sau đó đƣơc ly tâm để tách lấy phần huyết tƣơng.
3.3.6. Phƣơng pháp xử lý mẫu
Xử lý mẫu máu: ly tâm 1,2 ml máu trong 5 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút. Hút lấy 0,5 ml huyết tƣơng, bảo quản ở -80 o
C.
Mẫu ch y HPLC: xử lý theo phƣơng pháp của Catalin và Mase. Thêm vào 0,5 ml huyết tƣơng 0,1ml dung dịch carbamazepin 20 µg/ml, 0,2 ml đệm ammonium acetat 0,2M -
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
pH 5,0 và 4 ml ether. Trộn kĩ trong 3 phút và ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Hút lấy 3,5 ml dịch hữu cơ chuyển vào ống s ch, bốc hơi dung môi bằng hơi nitơ ở 40oC. Hòa tan mẫu trong 0,5 ml pha động (acetonitril / methanol / 2 mM đệm phosphat pH 5,0) (42/22/36 v/v/v), ly tâm tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút ở máy ly tâm l nh. Hút dịch trong, lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm trƣớc khi tiêm mẫu.
3.3.7. Xử lý k t quả
Phân tích số liệu và xử lí kết quả bằng Excel 2007.
Diện tích dưới đường cong trong khoảng thời gian 0 -> t
AUC0_t =
i=0 n-1
(ti+1 - ti) * (Ci + Ci+1) / 2
Trong đó:
- AUC0_t = diện tích dƣới đƣ ng cong trong khoảng th i gian từ 0 -> t - t = th i gian lấy máu
- C = nồng độ thuốc t i th i điểm lấy máu t - n = số th i điểm lấy máu
Diện tích dưới đường cong trong khoảng thời gian 0 -> ∞
AUC0_inf = AUC0_t + Ccuối / k
Trong đó:
- AUC0_inf = diện tích dƣới đƣ ng cong trong khoảng th i gian từ 0 ->∞ - k = hằng số tốc độ thanh thải
- AUC0_t = diện tích dƣới đƣ ng cong trong khoảng th i gian từ 0 -> t - Ccuối = nồng độ thuốc trong huyết tƣơng t i th i điểm lấy máu cuối cùng
Hằng số tốc độ thanh thải
ln Ct = ln b - t * k Trong đó:
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
- Ct = nồng độ thuốc t i th i điểm t - k = hằng số tốc độ thanh thải
Thời gian bán thải:
t1/2 = ln(2) / k Trong đó:
- t1/2 = th i gian bán thải - k = hằng số tốc độ thanh thải
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG PTX (PTX) BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÕ DÃY DIOT QUANG (PDA) PHƢƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÕ DÃY DIOT QUANG (PDA) 4.1.1. Điều kiện sắc kí
Hệ thống HPLC Shimadzu SPD-M20A.
Cột sắc kí Phenomenex Gemini 5u-C18-1108 250 x 4.60 mm x 4 micron.
Pha động: dung dịch đệm phosphat 0.02M pH 5.0 / methanol / acetonitril theo tỷ lệ 36/22/42 v/v/v.
Chƣơng trình ch y: đ ng dòng. Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. Đầu dò PDA: 227 nm. Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. Nhiệu độ buồng mẫu: 15 o
C. Nhiệt độ cột: 30 oC.
4.1.2. Tính phù hợp hệ thống
Dung dịch PTX chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong huyết tƣơng (số lần tiêm mẫu n = 6). Kết quả tính phù hợp hệ thống đƣợc thể hiện qua các thông số trong bảng 4.1:
Bảng 4.1 Thông số tính phù hợp hệ thống Thông số Trung bình %RSD Rt 5,679 ± ,003 0,111 H 79784,500 ± 284,637 0,874 S 931258,333 ± 4092,125 1,076 N 5232,950 ± 17,076 0,799 Rs 7,714 ± 0,017 0,549
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Nhận xét: các thông số sắc kí thỏa mãn yêu cầu chung của quy trình định lƣợng (%RSD < 2%).
4.1.3. Tính đ c hiệu
Tiến hành sắc kí mẫu huyết tƣơng trắng, mẫu thử tự t o (mẫu huyết tƣơng chứa PTX và nội chuẩn CAR có nồng độ lần lƣợt là 25 và 4 µg/ml) và mẫu chuẩn pha trong methanol có nồng độ tƣơng ứng với mẫu thử tự t o.
Kết quả trên sắc kí đồ hình 4.1, mẫu chuẩn và mẫu tự t o có các pic PTX và CAR tách hoàn toàn với các pic khác và có th i gian lƣu tƣơng ứng là 6,3 và 3,7 phút.
Phổ UV-Vis t i th i gian lƣu của pic chất khảo sát trong mẫu tự t o giống phổ UV-Vis t i th i gian lƣu của pic chất khảo sát trong mẫu chuẩn.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
(a)
(b)
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
(c)
(d)
Hình 4.1. (c) PTX trong methanol, (d) hỗn hợp CAR và PTX nồng độ 25 µg/ml
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013