Định nghĩa: độ đúng là mức độ sát gần của giá trị tìm thấy so với giá trị thực.
Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẽ so với giá trị trung bình. Độ đúng và độ chính xác đƣợc xác định cùng lúc
Tiến hành: thực hiện ít nhất t i 3 nồng độ trong ph m vi định lƣợng (một nồng độ gần với LLOQ, một nồng độ gần với điểm giới h n trên của đƣ ng chuẩn và một nồng độ ở gần điểm giữa). Mỗi nồng độ phải đƣợc xác định trên ít nhất 5 mẫu.
Yêu cầu: độ chính xác ở mỗi mức nồng độ có RSD không đƣợc vƣợt quá 15%, riêng t i LLOQ thì không đƣợc vƣợt quá 20%.
Độ đúng đƣợc biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học. Điều đó có thể đƣợc biểu thị bằng khả năng tìm l i tƣơng đối và phải nằm trong khoảng 85% - 115%, nhƣng có thể chấp nhận 80% - 120% đối với điểm gần LLOQ.
2.5.4. Giới hạn định lƣợng dƣới (lower limit of quantitation, LLOQ)
Định nghĩa: Giới h n định lƣợng dƣới là lƣợng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định đƣợc với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
Điểm thấp nhất của đƣ ng chuẩn nên đƣợc chấp nhận nhƣ giới h n định lƣợng dƣới nếu nhƣ đáp ứng tín hiệu của nó so với đáp ứng của mẫu trắng ít nhất bằng 5 lần (tỷ số S/N 5), và có thể xác định với độ chính xác trong khoảng 20%, độ đúng từ 80 – 120%.
Tiến hành: xác định LLOQ theo một trong hai cách sau Lập tỷ số tín hiệu của mẫu thử tự t o (S) và mẫu trắng (N).
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc.
Yêu cầu: LLOQ ít nhất phải thỏa mãn khả năng phân tích nồng độ của mẫu thử lấy ở th i điểm bằng 3 – 5 lần th i gian bán thải ho c bằng 1/10 đến 1/20 giá trị Cmax của chất phân tích.
2.5.5. Đƣờng chuẩn và khoảng tuy n tính
Định nghĩa: tính tuyến tính là khả năng luận ra các kết quả của phƣơng pháp dựa vào đƣ ng biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đ i lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ là một đƣ ng th ng (x) [hay trực tiếp tính toán dựa vào tƣơng quan tỷ lệ giữa đ i lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ (x)]
Miền giá trị là khoảng xác định thƣ ng đƣợc lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc vào việc ứng dụng dự định của quy trình, đƣợc thiết lập bởi việc kh ng định quy trình đã xây dựng có tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận đƣợc khi áp dụng định lƣợng chất phân tích.
Để xây dựng đƣ ng chuẩn, các mẫu thử nên đƣợc chuẩn bị trên cùng một dịch sinh học nhƣ mẫu thử trong nghiên cứu bằng cách cho chuẩn đối chiếu đã biết trƣớc nồng độ vào dịch sinh học.
Nồng độ của chuẩn đối chiếu dùng xây dựng đƣ ng chuẩn phải dựa vào ph m vi định lƣợng đƣợc dự đoán trong nghiên cứu thực tế.
Đƣ ng chuẩn bao gồm từ 6 – 8 điểm (trừ điểm 0) nằm trong ph m vi cần định lƣợng (có cả giới h n định lƣợng dƣới).
Tiến hành: chuẩn bị các dung dịch chuẩn đối chiếu pha trong dung môi. Thêm các dung dịch này vào trong dịch sinh học để thu đƣợc các dung dịch có nồng độ trong ph m vi định lƣợng. Tiến hành sắc ký ít nhất 2 lần cho mỗi dung dịch.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Thiết lập phƣơng trình hồi quy và vẽ đƣ ng biểu diễn sự tƣơng quan giữa nồng độ và đáp ứng.
Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phƣơng trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy.
Yêu cầu:
Độ lệch không quá 20% t i LLOQ
Độ lệch không quá 15% t i các nồng độ khác.
Ít nhất 4 trong 6 dung dịch chuẩn đ t yêu cầu trên, trong đó phải có LLOQ và dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất trong đƣ ng chuẩn.
2.5.6. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chi t, recovery)
Định nghĩa: tỷ lệ thu hồi là đáp ứng ghi nhận đƣợc từ một lƣợng chất phân tích thêm vào và chiết ra từ dịch sinh học, đƣợc so sánh với đáp ứng từ nồng độ thực của chất phân tích
Đáp ứng ghi nhận đƣợc từ một lƣợng chất phân tích thêm vào và chiết ra từ dịch sinh học, đƣợc so sánh với đáp ứng từ nồng độ thực của chất phân tích.
Tỷ lệ thu hồi của chất chiết đƣợc không nhất thiết phải là 100% nhƣng phải ổn định và chính xác. Tỷ lệ thu hồi thực nghiệm đƣợc xác định t i 3 nồng độ thấp, trung bình và cao của đƣ ng chuẩn.
Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh đáp ứng của chất phân tích chiết đƣợc từ mẫu thử tự t o ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình và cao) với đáp ứng của mẫu chuẩn đối chiếu không chiết (mẫu đối chiếu có cùng nồng độ đƣợc pha trong dung môi ho c trong dịch sinh học thu đƣợc sau khi xử lý, có độ phục hồi 100%).
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
2.5.7. Độ ổn định của mẫu thử
Định nghĩa: độ ổn định là mức độ l p l i những kết quả thu đƣợc của cùng một mẫu thử nhƣng đƣợc thử với những thay đổi của điều kiện môi trƣ ng thực hiện qui trình nhƣ thay đổi phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm viên, dụng cụ, thuốc thử, ngày, …
Độ ổn định của thuốc trong dịch sinh học phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và định lƣợng, tính chất hóa học của thuốc, môi trƣ ng sinh học và vật liệu chứa mẫu.
Độ ổn định cần đƣợc khảo sát ở các điều kiện và th i gian tƣơng tự nhƣ thực tế trong suốt quá trình từ thu thập mẫu, bảo quản, rã đông, xử lý và phân tích.
Các dung dịch khảo sát độ ổn định nên đƣợc pha loãng từ một dung dịch gốc của chất cần thử (chỉ đƣợc chuẩn bị ngay trƣớc khi pha loãng) trong môi trƣ ng dịch sinh học bảo đảm không có chất gây nhiễu và không có sự hiện diện của chất cần thử.
Độ ổn định của dung dịch gốc cũng nên đƣợc khảo sát.
2.5.7.1. Độ ổn định đông và rã đông
Độ ổn định của chất phân tích đƣợc xác định sau 3 chu kỳ làm đông l nh và rã đông. Thực hiện ở ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ cao và thấp đƣợc làm đông l nh ở nhiệt độ bảo quản dự kiến trong 24 gi và rã đông ở nhiệt độ phòng, sau khi rã đông hoàn toàn, các mẫu đƣợc làm l nh trở l i trong vòng 12 – 24 gi giống lần đầu, sau 3 chu kỳ nhƣ thế mẫu đƣợc đem đi phân tích.
Nếu mẫu phân tích không ổn định ở nhiệt độ dự kiến thì phải làm l nh ở nhiệt độ -70 oC.
2.5.7.2. Độ ổn định ngắn hạn
Thực hiện trên 3 mẫu khác nhau ở mỗi nồng độ cao và thấp, sau khi rã đông ở nhiệt độ phòng và giữ ở nhiệt độ này từ 4 – 24 gi , sau đó đem phân tích .
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
2.5.7.3. Độ ổn định dài hạn
Th i gian bảo quản trong đánh giá độ ổn định dài h n nên lớn hơn khoảng th i gian từ lúc lấy mẫu đến ngày phân tích mẫu cuối cùng.
Đƣợc xác định bằng cách bảo quản ít nhất 3 mẫu ở 2 nồng độ thấp và cao ở nhiệt độ bảo quản dự kiến (-20 oC ho c -70 o
C). Thể tích mẫu phải đủ cho phân tích ở 3 lần khác nhau.
Nồng độ của mẫu sau mỗi lần xác định đƣợc so sánh với giá trị trung bình của nồng độ tƣơng ứng ở ngày bắt đầu thử nghiệm độ ổn định dài h n.
2.5.7.4. Độ ổn định dung dịch gốc
Đƣợc đánh giá ở nhiệt độ phòng ít nhất 6 gi .
Nếu dung dịch gốc đƣợc bảo quản ở điều kiện l nh ho c đông l nh trong một th i gian nhất định thì cũng phải chứng minh đƣợc độ ổn định.
Sau th i gian bảo quản nhất định, độ ổn định sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách so sánh độ đáp ứng của dung dịch sau th i gian bảo quản với dung dịch gốc ngay khi đƣợc chuẩn bị.
2.5.7.5. Độ ổn định dung dịch sau khi pha
Độ ổn định của mẫu sau khi đƣợc xử lý, kể cả th i gian mẫu đƣợc đ t trong bộ phận tiêm mẫu tự động nên đƣợc xác định.
Độ ổn định của thuốc, nên đƣợc đánh giá trong khoảng th i gian phân tích dự kiến tất cả các mẫu, sẽ đƣợc thẩm định bằng cách xác định nồng độ của thuốc dựa vào đƣ ng cong chuẩn.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
2.6.KĨ THUẬT CHIẾT TÁCH ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH 2.6.1. Kĩ thuật tách [9] 2.6.1. Kĩ thuật tách [9]
Hiện nay có rất nhiều kĩ thuật tách áp dụng trong quy trình định lƣợng thuốc trong dịch sinh học. Kĩ thuật có nhiều ƣu điểm nhất là điện di mao quản. Bên c nh đó còn có nhiều kĩ thuật khác dựa trên nguyên tắc sắc kí bao gồm sắc kí khí và sắc kí lỏng.
Điện di dựa vào sự di chuyển của các h t tích điện dƣới tác dụng của điện trƣ ng. Quá trình tách phụ thuộc vào tốc độ di chuyển khác nhau của các chất tan. Khi có một điện trƣ ng ngoài tác động lên dung dịch có h t tích điện, mỗi ion sẽ di chuyển theo về phía điện cực đối diện. Tốc độ di chuyển của mỗi lo i h t tùy thuộc vào bản chất môi trƣ ng, kích thƣớc h t và cƣ ng độ điện trƣ ng.
Trong sắc kí khí, mẫu đƣợc làm bay hơi và tiêm vào cột phân tích. Mẫu sau khi tiêm đƣợc di chuyển qua cột bằng dòng khí trơ ho t động nhƣ một pha động. Các khí mang thƣ ng dùng là nitrogen, argon carbon dioxid và helium. Cột thƣ ng đƣợc tráng bằng pha tĩnh lỏng. Nhiệt độ cột phụ thuộc vào điểm sôi của mẫu đƣợc bay hơi. Có nhiều lo i bộ phận phát hiện (detector) sử dụng trong sắc kí khí gồm có detector ion hóa ngọn lửa, ngọn lửa trắc quang, bắt điện tử và dẫn nhiệt. Mỗi lo i detector phù hợp cho từng điều kiện tách các lo i mẫu khác nhau.
Kĩ thuật tách thƣ ng đƣợc sử dụng nhất trong phân tích dịch sinh học là sắc kí lỏng (LC). LC, hay còn gọi là sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), là một quá trình phân tích, phân tách từng thành phần trong một hỗn hợp và thƣ ng sử dụng cho cả định tính và định lƣợng. Thành phần cơ bản của bất kì một hệ thống LC nào cũng bao gồm: bơm/ hệ thống cung cấp dung môi, bơm tiêm, cột phân tích (pha tĩnh), bộ phận phát hiện (detector) và máy tính (PC). Pha động chứa mẫu đƣợc bơm vào hệ thống và tƣơng tác với pha tĩnh-phần quan trọng nhất của hệ thống. Cột với pha tĩnh bên trong là nơi quá trình phân tách xảy ra ở đây. Các thành phần sau khi đƣợc tách ra sẽ đi đến detector trƣớc khi chảy ra ngoài ho c đƣợc thu l i. Đối với hệ thống HPLC cũng có nhiều lo i
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
detector khác nhau nhƣ detector UV-Vis, huỳnh quang, dãy diod quang (PDA) và khổi phổ (MS).
Hình 2.10 Sơ đồ đơn giản hệ thống HPLC
2.6.2. Kĩ thuật chi t[9]
Trƣớc khi đƣa mẫu sinh học vào phân tích bằng hệ thống HPLC, mẫu phải đƣợc xử lý và làm s ch. Lƣợng thuốc trong mẫu phải đƣợc chiết ra với độ phục hồi cao nhất có thể. Có nhiều kĩ thuật chiết đƣợc áp dụng cho các mẫu sinh học nhƣ tủa protein (PP), chiết lỏng – lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE).
2.6.2.1. PP[9]
PP là một kĩ thuật chiết khá tốt trong đó một dung môi hay acid ho c base m nh đƣợc thêm vào mẫu sinh học để tủa protein dƣới d ng h t nhỏ, sau đó đem ly tâm, dịch nổi chứa chất cần phân tích đƣợc thu l i và đem đi phân tích. Độ tan của protein trong
Buồng tiêm mẫu
Bộ phận phát hiện Máy tính Thu hồi Cột sắc kí Dung môi Bơm
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
dung dịch đệm phụ thuộc vào bản chất của acid amin phân cực hay không phân cực cấu thành nên protein. Những protein có tỷ lệ acid amin kị nƣớc cao trên bề m t sẽ không thể hòa tan trong nƣớc. Giữa các protein có lực hút hay đẩy tĩnh điện phụ thuộc vào bản chất môi trƣ ng chứa chúng. PP xảy ra bằng cách thêm vào một tác nhân tủa (nhƣ h t gel trong kĩ thuật lọc gel) vào dịch chứa protein. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là dịch chiết vẫn còn chứa nhiều thành phần phức t p và dịch nổi vẫn có nguy cơ bị tủa.
2.6.2.2. LLE [9]
LLE là phƣơng pháp chiết dựa vào sự hòa trộn của hai chất lỏng không đồng tan. Sự phân tán lỏng lỏng đƣợc t o ra bằng quá trình trộn đƣợc tách ra bằng trọng lực ho c bằng lực ly tâm sau đó. Đối với mẫu sinh học thƣ ng một dung môi hữu cơ đƣợc thêm vào và trộn lên. Thuốc cần chiết di chuyển từ pha nƣớc vào pha hữu cơ có độ hòa tan tốt hơn, không kèm protein và lipid. Một nhƣợc điểm lớn của LLE là khó tự động hóa và lƣợng dung môi hữu cơ tiêu tốn khá lớn. LLE thƣ ng đòi hỏi kèm theo quá trình bốc hơi đến khô và phục hồi mẫu.
Hình 2.11 Các bƣớc chính trong quá trình chiết lỏng – lỏng
Dịch nƣớc
Dung môi hữu cơ
Thêm vào pha hữu cơ s ch Trộn để các phân tử phân vùng Các pha đƣợc ổn địch và chia tách bằng trọng lực
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
2.6.2.3. SPE [9]
SPE – một trong những kĩ thuật chiết phổ biến và rẻ nhất – sử dụng một pha rắn và một pha lỏng để phân tách chất trong mẫu sinh học. Quá trình chiết SPE tổng quát bao gồm 4 bƣớc: ổn định cột, đƣa mẫu lên cột, rửa cột và rửa giải chất phân tích. Hộp hay đĩa SPE đƣợc điều hòa với dung môi (làm ẩm) sau đó mẫu đƣợc đƣa lên cột và cho ch y qua cột. Nếu pha tĩnh đƣợc chọn chính xác, chất phân tích đƣợc giữ l i trên cột trong khi phần thừa dịch sinh học sẽ đƣợc thải ra ngoài. Một dung môi có ái lực với chất phân tích đƣợc cho vào và ch y qua cột để rửa giải chất phân tích với thể tích nhỏ nhất có thể. Một ƣu điểm lớn của SPE là có thể tự động hóa với th i gian tối ƣu và công suất tăng.
Hình 2.12 Các bƣớc chính trong quá trình chiết rắn SPE
Bƣớc 1 Bƣớc 2 Bƣớc 3 Bƣớc 4
Điều kiện hóa Thêm mẫu Rửa cột Rửa giải
Các chất ảnh hƣởng trong dịch rửa giải
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Thỏ cái khỏe m nh, n ng từ 2-2,5 kg, chƣa qua thử nghiệm. Thỏ mua về đƣợc nuôi trong môi trƣ ng thử nghiệm 1 tuần trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.
3.2.HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ NGHIỆM 3.2.1. Thuốc thử 3.2.1. Thuốc thử
PTX 6 mg/ml đƣợc bào chế ở d ng dung dịch, lọ 30 mg/5 ml t i Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh dƣới sự phối hợp nghiên cứu của bộ môn Hóa Dƣợc, bộ môn Công Nghiệp Dƣợc, khoa Dƣợc ĐH Dƣợc Tp.HCM và Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM. Thuốc đ t tiêu chuẩn dƣợc điển Mỹ - USP 35.
Thành phần công thức 1 Thành phần công thức 2 Paclitaxel Acid citric Cremophor EL Ethanol khan Paclitaxel Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin Polyvinyl pyrolidon K30 (PVP K30) PEG 400 Tween khan Nƣớc cất pha tiêm 3.2.2. Thuốc đối chứng
PTX Stragen®6 mg/ml d ng đóng gói 30 mg/5 ml, số lô X070, số đăng kí VN1 – 423 – 11, h n dùng 10.2014, do công ty Haupt pharma Wolfratshausen GmbH (Pfaffenriederer Strabe 5, D-82515 Wolfratshausen, Germany) sản xuất.
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013
Nƣớc muối sinh lý dùng để pha tiêm: natri chlorid (NaCl) 0,9 %, chai 500 ml, số lô 13178PN, số đăng kí VD – 10634 – 10, ngày sản xuất 13/05/13, h n dùng 13/05/16, do công ty Mekophar Chemical Pharmaceutical Joint-Stock (297/5 Lý Thƣ ng Kiệt, quận