Vật liệu và phƣơng tiện thí nghiệm - khảo sát khả- 123docz.net

Nguồn nấm gây lem lép hạt lúa và vi khuẩn đối kháng nhận từ bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ:

 Nguồn nấm: Fusarium moniliforme, Curvularia lunata, Bipolaris oryzae, Pinatubo oryzae và Trichothecium sp.

 Nguồn vi khuẩn: AGB4 (Bacillus sp.), AGB17 (Bacillus pumilus), AGB27 (Bacillus megaterium).

Thiết bị: tủ cấy vi sinh, tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ƣớt, tủ auto clave, máy đo OD, kính hiển vi…

Dụng cụ: đĩa Petri, ống nghiệm, giấy thấm, kéo, kẹp, nƣớc cất thanh trùng, cồn, sổ ghi chép, viết, giấy báo, hóa chất…

Các loại môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm: Môi trƣờng King’s B (Atlas, 2004)

Peptone 20 g K2HPO4.3H2O 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Agar 20 g Glycerol 15 ml Nƣớc cất 1000 ml pH 7,2

Môi trƣờng PDA (Shurtleff và Averre III, 1997)

Khoai tây 200 g Đƣờng Dextrose 20 g

Agar 20 g

Nƣớc cất 1000 ml

pH 6,7

Môi trƣờng PDAP (Louis và Cooke, 1985)

Khoai tây 250 g Peptone 15 g Đƣờng Dextrose 20 g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 ml pH 6,5 2.2 PHƢƠNG PHÁP

Khảo sát khả năng đối kháng của ba chủng vi khuẩn với một số nấm gây bệnh lem lép hạt phổ biến nhằm đánh giá khả năng ức chế khuẩn ty của ba chủng vi khuẩn đối với nấm gây bệnh lem lép hạt lúa.

Nguồn nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA đặc trƣớc 7 ngày. Nguồn vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng King’B đặc trƣớc 2 ngày. Mật số vi khuẩn sử dụng là 107cfu/ml. Khoanh giấy vô trùng thấm huyền phù vi khuẩn 10 giây, sau đó vớt ra đặt trên giấy thấm thanh trùng để khô khoảng 30 phút.

Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại, mỗi chủng vi khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDAP đặc với những điểm xung quanh cách tâm 2,5 cm (3 khoanh giấy vô trùng có thấm huyền phù vi khuẩn đặt ở 3 điểm, điểm còn lại là khoanh giấy vô trùng thấm nƣớc cất thanh trùng ), ở giữa là khoanh nấm với đƣờng kính là 5 mm. Các đĩa Petri đƣợc đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Chỉ tiêu theo dõi: Đo và ghi nhận bán kính vành khăn vô khuẩn và bán kính khuẩn ty nấm ở thời điểm 3, 4, 5 NSKC đối với nấm Fusarium moniliforme, Curvularia lunata, Bipolaris oryzae, Trichothecium sp. và thời điểm 5, 9, 12 NSKC đối với nấm Pinatubo oryzae khi khuẩn ty nấm chạm đến mép khoanh đối chứng.

Hình 2.1 Phƣơng pháp trắc nghiệm khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với nấm trên môi trƣờng PDAP đặc có lặp lại.

Tính hiệu suất đối kháng (HSĐK)

HSĐK (%) = [(BKKLđc – BKKLvk)/BKKLđc]x 100 - BKKLđc: bán kính khuẩn ty về phía đối chứng.

- BKKLvk: bán kính khuẩn ty về phía vi khuẩn.

Hiệu suất đối kháng đƣợc đánh giá theo thang đánh giá của Soytong (1988; trích bởi Noveriza và Quimio, 2004).

++++ : đối kháng rất cao >75% +++ : đối kháng cao 61-75%

++ : đối kháng trung bình 51-60% + : đối kháng thấp <50%

- : không có đối kháng

Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC

VK1

VK2 Nấm VK3

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ-THẢO LUẬN

3.1 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM FUSARIUM MONILIFORME VÀ AGB27 VỚI NẤM FUSARIUM MONILIFORME

Từ kết quả Bảng 3.1 cho thấy ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm Fusarium moniliforme thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC, khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5%. Chủng AGB4 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (6,00 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB17 (5,00 mm), AGB27 (4,40 mm). Đến thời điểm 4, 5 NSKC bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng AGB4 có sự khác biệt với chủng AGB27 nhƣng không khác biệt với chủng AGB17. Bán kính vành khăn vô khuẩn ở thời điểm 4 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đạt lần lƣợt là 5,60 mm, 4,80 mm và 4,20 mm (Hình 3.1).

Bảng 3.1 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với

nấm Fusarium moniliforme

Cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng qua các thời điểm. Hiệu suất đối kháng ở từng thởi điểm 3, 4, 5 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 khác biệt không ý nghĩa, thời điểm 3 NSKC dao động từ 25,60-29,20%.Theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng ở thời điểm 3, 4 NSKC của cả 3 chủng AGB4, AGB17 và AGB27 đều đạt ở mức đối kháng yếu (nhỏ hơn 50%). Đến thời

Nghiệm thức

Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 6,00 a 5,60 a 5,40 a 27,00 a 44,20 a 54,80 a AGB17 5,00 b 4,80 ab 4,40 ab 25,60 a 44,20 a 53,40 a AGB27 4,40 b 4,20 b 4,00 b 29,20 a 46,80 a 56,40 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 17,42 20,32 23,37 28,98 14,50 13,08

Ghi chú: *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % NSCK: Ngày sau khi cấy Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%

điểm 5 NSKC cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu suất đối kháng trên 53% đạt mức đối kháng trung bình.

Kết quả cho thấy ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Fusarium moniliforme qua các thời điểm. Kết quả cao hơn ghi nhận của Phan Thị Kiều Nga (2008), bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng vi khuẩn AGB4 trên nấm Fusarium spp. là 4,00 mm.

3.2 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM CURVULARIA LUNATA VÀ AGB27 VỚI NẤM CURVULARIA LUNATA

Ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm

Curvularia lunata thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.2). Chủng AGB17 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (6,00 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB4 (3,60 mm), AGB27 (4,20 mm). Đến thời điểm 4 và 5 NSKC giữa các chủng vi khuẩn có sự khác biệt ý nghĩa giống thời điểm 3 NSKC (Hình 3.2). ĐC B AGB4 AGB17 AGB27 ĐC

Hình 3.1 Bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn với nấm Fusarium

moniliforme thời điểm 4 NSKC (A) và 5 NSKC (B).

A AGB4

AGB1 7

Bảng 3.2 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với

nấm Curvularia lunata

Qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Thời điểm 3 NSKC, chủng vi khuẩn AGB4 và AGB27 có hiệu suất đối kháng cao (39,60%, 38,80%) và khác biệt có ý nghĩa so với chủng AGB17 (33,40%). Đến thời điểm 4, 5 NSKC hiệu suất đối kháng của ba chủng không khác biệt đều đạt trên 50%. Tuy nhiên, theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng của cả 3 chủng AGB4 (54,20%), AGB17 (50,00%) và AGB27 (52,00%) ở thời điểm 4 NSKC đạt ở mức đối kháng trung bình và đạt mức đối kháng cao ở thời điểm 5 NSKC.

Tóm lại, ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Curvularia lunata qua các thời điểm. Kết quả bán kính vành khăn vô khuẩn thấp hơn ghi nhận của Phan Thị Kiều Nga (2008), bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng AGB4 trên nấm Curvularia spp. là 6,60 mm.

Nghiệm thức

Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 3,60 b 3,20 b 3,00 b 39,60 a 54,20 a 64,20 a AGB17 6,00 a 5,80 a 5,60 a 33,40 b 50,00 a 61,00 a AGB27 4,20 b 3,80 b 3,60 b 38,80 a 52,00 a 62,60 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 30,74 33,51 28,86 11,50 8,27 6,07

Ghi chú: *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % NSKC: Ngày sau khi cấy Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%

3.3 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM BIPOLARIS ORYZAE VÀ AGB27 VỚI NẤM BIPOLARIS ORYZAE

Ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm

Bipolaris oryzae thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.3). Chủng AGB4 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (4,60 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB17 (3,20 mm), AGB27 (3,40 mm). Thời điểm 4 và 5 NSKC các chủng vi khuẩn vẫn có sự khác biệt ý nghĩa giống thời điểm 3 NSKC (Hình 3.3)

Bảng 3.3 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với

nấm Bipolaris oryzae

Nghiệm thức Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 4,60 a 4,20 a 4,00 a 33,60 a 49,20 a 62,60 a AGB17 3,20 b 3,00 b 2,60 b 34,60 a 50,80 a 61,60 a AGB27 3,40 b 3,20 b 2,80 b 38,60 a 51,20 a 61, 00 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 23,96 22,75 26,06 18,39 10,92 7,41

Ghi chú: *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 %

Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%

AGB4 AGB27

AGB17

ĐC

Hình 3.2 Bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn với nấm Curvularia lunata

thời điểm 4 NSKC (A) và 5 NSKC (B).

A B

ĐC

AGB4 AGB27

Qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Hiệu suất đối kháng ở từng thởi điểm 3, 4, 5 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 không khác biệt nhau, thời điểm 3 NSKC dao động từ 33,60-38,80%. Tuy nhiên, theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng ở thời điểm 3 NSKC của cả 3 chủng AGB4, AGB17 và AGB27 đều đạt ở mức đối kháng yếu. Thời điểm 4 NSKC, chủng AGB17 và AGB27 có hiệu suất đối kháng tăng lên mức đối kháng trung bình (50,80% và 51,20%). Đến thời điểm 5 NSKC cả ba chủng đều có hiệu suất đối kháng trên 60% đạt mức đối kháng cao.

Tóm lại, ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Bipolaris oryzae qua các thời điểm. Kết quả ghi nhận của Phan Thị Kiều Nga (2008), bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng vi khuẩn AGB4 trên nấm

Bipolaris spp. là 6,28 mm cao hơn kết quả ghi nhận ở Bảng 3.3 (4,60 mm).

3.4 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM PINATUBO ORYZAE VÀ AGB27 VỚI NẤM PINATUBO ORYZAE

Kết quả Bảng 3.4 cho thấy ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm Pinatubo oryzae thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 5, 9 và 12 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5%. Bán kính vành khăn vô khuẩn ở từng thời điểm của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 khác biệt không ý nghĩa. Thời điểm 5 NSKC, có giá trị cao nhất trong các thời điểm, bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn lần lƣợt là 6,20, 6,80, 5,40 mm. Đến thời điểm 12 NSKC, bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng vi khuẩn AGB4 là 5,40 mm, AGB17 là 5,60 mm và AGB27 là 4,60 mm (Hình 3.4)

AGB4

AGB17

AGB27 AGB4 AGB27

AGB17

ĐC ĐC

A B

Hình 3.3 Bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn với nấm Bipolaris oryzae

Bảng 3.4 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với

nấm Pinatubo oryzae

Qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Hiệu suất đối kháng ở từng thởi điểm 5, 9, 12 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 không khác biệt nhau, thời điểm 5 NSKC dao động từ 31,60-39,00%. Theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng ở thời điểm 5 NSKC của cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều đạt ở mức đối kháng yếu. Thời điểm 9 NSKC, chủng vi khuẩn AGB4 và AGB17 có hiệu suất đối kháng tăng lên mức đối kháng trung bình (51,00% và 52,00%). Đến thời điểm 12 NSKC cả ba chủng vi khuẩn đều có hiệu suất đối kháng trên 60% đạt mức đối kháng cao.

Vậy qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả ức chế khuẩn ty và hiệu suất đối kháng với nấm Pinatubo oryzae.

Nghiệm thức

Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 5 NSKC 9 NSKC 12 NSKC 5 NSKC 9 NSKC 12 NSKC AGB4 6,20 a 5,60 a 5,40 a 35,00 a 51,00 a 61,40 a AGB17 6,80 a 5,80 a 5,60 a 39,00 a 52,00 a 62,20 a AGB27 5,40 a 4,80 a 4,60 a 31,60 a 49,80 a 60,00 a Đối chứng 0,0 b 0,0 b 0,0 b 0,0 b 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 32,06 31,96 33,68 24,05 15,83 10,76

3.5 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM TRICHOTHECIUM SP. VÀ AGB27 VỚI NẤM TRICHOTHECIUM SP.

Ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả ức chế nấm

Trichothecium sp. thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.1). Chủng AGB27 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (3,40 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB4 (2,40 mm) và AGB17 (2,60 mm). Thời điểm 4 NSKC bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng AGB27 (2,60 mm) khác biệt không ý nghĩa với chủng AGB17 (2,20 mm) nhƣng khác biệt ý nghĩa với chủng AGB4 (1,8 mm). Đến thời điểm 5 NSKC bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng AGB27 (2,20 mm) khác biệt ý nghĩa với hai chủng AGB4 (1,40 mm) và AGB17 (1,60 mm) (Hình 3.5). A ĐC ĐC AGB27 AGB27 AGB17 AGB4 AGB17 AGB4 B

Hình 3.4 Bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn với nấm Pinatubo oryzae thời điểm 9 NSKC (A) và 12 NSKC (B).

Bảng 3.5 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với

nấm Trichothecium sp.

Nghiệm thức

Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 2,40 b 1,80 b 1,40 b 19,20 a 39,60 a 57,00 a AGB17 2,60 b 2,20 ab 1,60 b 22,20 a 38,60 a 56,40 a AGB27 3,40 a 2,60 a 2,20 a 17,60 a 39,40 a 59,60 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 22,59 25,35 34,40 35,42 14,42 6,24

Qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Theo từng thời điểm hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn khác biệt không ý nghĩa. Hiệu suất đối kháng thời điểm 3 NSKC tƣơng đối thấp dao động từ 17,60-22,20%. Thời điểm 4NSKC hiệu suất đối kháng tăng lên so với thời điểm 3NSKC. Tuy nhiên, theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng của cả 3 chủng AGB4 (39,60%), AGB17 (38,60%) và AGB27 (39,40%) ở thời điểm 4 NSKC đạt ở mức đối kháng yếu và đạt mức đối kháng trung bình ở thời điểm 5 NSKC hiệu suất dao động từ 56,40- 59,60%.

Tóm lại, ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Trichothecium sp. qua các thời điểm, nhƣng hiệu quả đối kháng tƣơng đối yếu.

3.6 SO SÁNH KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI VỚI NĂM LOÀI NẤM GÂY BỆNH LEM LÉP HẠT LÚA

Kết quả ghi nhận ở Bảng 3.6 cho thấy, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả ức chế khuẩn ty của một số loài nấm lem lép hạt lúa, số liệu ghi nhận khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.

Trong 5 loài nấm đƣợc khảo sát thì chủng vi khuẩn AGB4 có bán kính vành khăn vô khuẩn trên nấm Pinatubo oryzae (5,40 mm) và Fusarium moniliforme (5,40