bệnh cây trồng
Mew và ctv. (1993), chọn đƣợc một số dòng vi khuẩn có hiệu quả đối với bệnh đốm vằn hại lúa nhƣ Bacillus subtilis 33, Bacillus subtilis 76, Pseudomonas fluorescens 7-14, Pseudomonas cepacia 6854, P. cepacia 1821 (trích dẫn từ Biện Phƣơng Đông, 2005).
Raupach và Kloepper (1998), cho biết xử lý hạt dƣa hấu với hỗn hợp
Bacillus pumilus (INR7), B. subtilis (GB03) và Curtobacterium flaccumfaciens
(ME1) với mật số 5x109 bào tử/hạt sẽ làm giảm sự phát triển của bệnh đốm lá và thán thƣ.
Theo Basha và Ulaganathan (2002), chủng vi khuẩn Bacillus sp. BC121 đƣợc phân lập từ vùng rễ cây lúa miến thể hiện khả năng ức chế cao đối với nấm
Curvularia lunata với vành khăn vô khuẩn 0,5-1 cm và phát triển lên bề mặt sợi nấm vào 10 ngày sau khi thí nghiệm. Cho thấy, chủng vi khuẩn này có khả năng tiết ra enzyme Chitinase, ức chế sự phát triển của nấm C. lunata lên đến 60% về trọng lƣợng khô.
Jetiyanon và ctv. (2003), sử dụng 2 dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens IN937a và Bacillus pumilus IN937a để phòng trừ nấm
Colletotrichumgloeosporioides gây hại trên cà chua (trích dẫn từ Siddiqui, 2006). Đỗ Tấn Dũng (2004), ghi nhận hai loại vi khuẩn Bacillus subtilis và
Pseudomonas fluorescens có khả năng cạnh tranh, đối kháng, ức chế sự xâm nhiễm và gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum.
Kloepper và ctv. (2004), cho rằng các loài thuộc chi Bacillus nhƣ Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, B. pasteurii, B. cereus, B. pumilus, B. mycoides, và B. sphaericus có khả năng kích thích tính kháng hay đối kháng giúp giảm bệnh do nhiều tác nhân và trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Tuy có ít báo cáo về chi
15
Bacillus nhƣng đa số các nghiên cứu mang tính chất ứng dụng. Sản phẩm Yield Shield với thành phần hoạt chất là nội bào tử của B. pumilus, chủng GB34 đƣợc đăng kí tại Mỹ năm 2003 để phòng trị bệnh trên đậu nành.
Usha và ctv. (2006), xử lý vi khuẩn Bacillus megaterium vào đất có tác dụng làm giảm bệnh thối rễ trên cây trà, cơ chế làm giảm bệnh này có thể là do tác động của vi khuẩn trong quá trình hòa tan lân, sản xuất IAA, siderophore và các chất biến dƣỡng kháng nấm.
Theo Phan Thị Kiều Nga (2008), 6 chủng vi khuẩn Bacillus spp. đều có khả năng đối kháng tốt với 4 loại nấm gây bệnh trên hạt lúa là Diplodia spp.,
Trichothecium spp., Curvularia spp. và Trichoconis spp.
Shanmugam và Narayanasamy (2009), ghi nhận vi khuẩn Bacillus licheniformis MML2501 có hiệu quả ức chế sự tăng trƣởng sợi nấm Fusarium oxysporum, Fusarium udum, Bipolaris oryzae, Pyricularia oryzae, Alternaria alternata, Macrophomina phaseolina và Curvularia sp.
Trƣơng Thị Bích Ngân (2009), cũng ghi nhận vi khuẩn Bacillus spp. và
Pseudomonas spp. có khả năng đối kháng cao với hai chủng nấm Fusarium oxysporum f.sp. niveum và Didymella bryoniae gây bệnh trên dƣa hấu trong điều kiện in vitro.
Thí nghiệm của Lý Thu Thảo (2010), đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với ba dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng cho kết quả 7 chủng có khả năng đối kháng tốt, tất cả các chủng này đều thuộc chi Bacillus.
Kumar và ctv. (2011), cho biết đã phân lập đƣợc 388 chủng vi khuẩn từ vùng rễ của cây ớt trong suốt thời gian từ 2008-2010. Các chủng vi khuẩn đƣợc xác định gồm 4 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus spp., hai chủng thuộc mỗi chi
Pseudomonas spp. và Enterobacter spp., một chủng thuộc Alcaligenes faecalis và
Klebsiella spp. Khi tiến hành thí nghiệm trong điều kiện in vitro với tất cả 10 chủng trên cho thấy có khả năng đối kháng với các nấm Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Colletotrichum capsici, Rhizoctonia solani, Macrophomina spp. và
Pythium spp.
Li và ctv. (2011), cho biết nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện trên vi khuẩn
Bacillus trong những năm 1980. YIB (Yield Increasing Bacterial) là một ví dụ cho sự thành công của PGPR mà nó đã đƣợc sử dụng trên quy mô lớn ở Trung Quốc. Kể từ đó, nghiên cứu trên Bacillus PGPR đã tăng mạnh với khả năng tạo ta nội bào tử và chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Cho đến nay, có 7
16
chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đã đƣợc xem nhƣ là các loại thuốc trừ sâu sinh học, một số đƣợc xem nhƣ phân bón sinh học ở Trung Quốc.
Khi nghiên cứu về biện pháp sinh học phòng trừ bệnh than thƣ trên ớt, Nguyễn Thị Hồng Đào (2011), kết luận rằng có 8 trong tổng số 28 chủng vi khuẩn
Bacillus có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp. ST2 trong điều kiện in vitro. Trong đó, có ba chủng có khả năng đối kháng mạnh với hiệu suất lần lƣợt là 25,0%, 40,7% và 44,3%.
Vi khuẩn Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. cereus và B. mycoides có khả năng ức chế một số nấm bệnh nhƣ Rhizoctonia, Fusarium, Sclerotinia, Sclerotium, Gaeummanomyces, Nectria, Pythium, Phytophthora và Verticillium (Castillo và ctv., 2013).
17
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG TIỆN-PHƢƠNG PHÁP 2.1 PHƢƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 11/2013 đến 2/2014.
Địa điểm: phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học, bộ môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu và phƣơng tiện thí nghiệm
Nguồn nấm gây lem lép hạt lúa và vi khuẩn đối kháng nhận từ bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ:
Nguồn nấm: Fusarium moniliforme, Curvularia lunata, Bipolaris oryzae, Pinatubo oryzae và Trichothecium sp.
Nguồn vi khuẩn: AGB4 (Bacillus sp.), AGB17 (Bacillus pumilus), AGB27 (Bacillus megaterium).
Thiết bị: tủ cấy vi sinh, tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ƣớt, tủ auto clave, máy đo OD, kính hiển vi…
Dụng cụ: đĩa Petri, ống nghiệm, giấy thấm, kéo, kẹp, nƣớc cất thanh trùng, cồn, sổ ghi chép, viết, giấy báo, hóa chất…
Các loại môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm: Môi trƣờng King’s B (Atlas, 2004)
Peptone 20 g K2HPO4.3H2O 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Agar 20 g Glycerol 15 ml Nƣớc cất 1000 ml pH 7,2
18
Môi trƣờng PDA (Shurtleff và Averre III, 1997)
Khoai tây 200 g Đƣờng Dextrose 20 g
Agar 20 g
Nƣớc cất 1000 ml
pH 6,7
Môi trƣờng PDAP (Louis và Cooke, 1985)
Khoai tây 250 g Peptone 15 g Đƣờng Dextrose 20 g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 ml pH 6,5 2.2 PHƢƠNG PHÁP
Khảo sát khả năng đối kháng của ba chủng vi khuẩn với một số nấm gây bệnh lem lép hạt phổ biến nhằm đánh giá khả năng ức chế khuẩn ty của ba chủng vi khuẩn đối với nấm gây bệnh lem lép hạt lúa.
Nguồn nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA đặc trƣớc 7 ngày. Nguồn vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng King’B đặc trƣớc 2 ngày. Mật số vi khuẩn sử dụng là 107cfu/ml. Khoanh giấy vô trùng thấm huyền phù vi khuẩn 10 giây, sau đó vớt ra đặt trên giấy thấm thanh trùng để khô khoảng 30 phút.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 lần lặp lại, mỗi chủng vi khuẩn đƣợc xem là một nghiệm thức. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDAP đặc với những điểm xung quanh cách tâm 2,5 cm (3 khoanh giấy vô trùng có thấm huyền phù vi khuẩn đặt ở 3 điểm, điểm còn lại là khoanh giấy vô trùng thấm nƣớc cất thanh trùng ), ở giữa là khoanh nấm với đƣờng kính là 5 mm. Các đĩa Petri đƣợc đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo và ghi nhận bán kính vành khăn vô khuẩn và bán kính khuẩn ty nấm ở thời điểm 3, 4, 5 NSKC đối với nấm Fusarium moniliforme, Curvularia lunata, Bipolaris oryzae, Trichothecium sp. và thời điểm 5, 9, 12 NSKC đối với nấm Pinatubo oryzae khi khuẩn ty nấm chạm đến mép khoanh đối chứng.
19
Hình 2.1 Phƣơng pháp trắc nghiệm khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với nấm trên môi trƣờng PDAP đặc có lặp lại.
Tính hiệu suất đối kháng (HSĐK)
HSĐK (%) = [(BKKLđc – BKKLvk)/BKKLđc]x 100 - BKKLđc: bán kính khuẩn ty về phía đối chứng.
- BKKLvk: bán kính khuẩn ty về phía vi khuẩn.
Hiệu suất đối kháng đƣợc đánh giá theo thang đánh giá của Soytong (1988; trích bởi Noveriza và Quimio, 2004).
++++ : đối kháng rất cao >75% +++ : đối kháng cao 61-75%
++ : đối kháng trung bình 51-60% + : đối kháng thấp <50%
- : không có đối kháng
Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC
VK1
VK2 Nấm VK3
20
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ-THẢO LUẬN
3.1 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM FUSARIUM MONILIFORME VÀ AGB27 VỚI NẤM FUSARIUM MONILIFORME
Từ kết quả Bảng 3.1 cho thấy ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm Fusarium moniliforme thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC, khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5%. Chủng AGB4 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (6,00 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB17 (5,00 mm), AGB27 (4,40 mm). Đến thời điểm 4, 5 NSKC bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng AGB4 có sự khác biệt với chủng AGB27 nhƣng không khác biệt với chủng AGB17. Bán kính vành khăn vô khuẩn ở thời điểm 4 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đạt lần lƣợt là 5,60 mm, 4,80 mm và 4,20 mm (Hình 3.1).
Bảng 3.1 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với
nấm Fusarium moniliforme
Cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng qua các thời điểm. Hiệu suất đối kháng ở từng thởi điểm 3, 4, 5 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 khác biệt không ý nghĩa, thời điểm 3 NSKC dao động từ 25,60-29,20%.Theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng ở thời điểm 3, 4 NSKC của cả 3 chủng AGB4, AGB17 và AGB27 đều đạt ở mức đối kháng yếu (nhỏ hơn 50%). Đến thời
Nghiệm thức
Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 6,00 a 5,60 a 5,40 a 27,00 a 44,20 a 54,80 a AGB17 5,00 b 4,80 ab 4,40 ab 25,60 a 44,20 a 53,40 a AGB27 4,40 b 4,20 b 4,00 b 29,20 a 46,80 a 56,40 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 17,42 20,32 23,37 28,98 14,50 13,08
Ghi chú: *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % NSCK: Ngày sau khi cấy Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%
21
điểm 5 NSKC cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu suất đối kháng trên 53% đạt mức đối kháng trung bình.
Kết quả cho thấy ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Fusarium moniliforme qua các thời điểm. Kết quả cao hơn ghi nhận của Phan Thị Kiều Nga (2008), bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng vi khuẩn AGB4 trên nấm Fusarium spp. là 4,00 mm.
3.2 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM CURVULARIA LUNATA VÀ AGB27 VỚI NẤM CURVULARIA LUNATA
Ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm
Curvularia lunata thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.2). Chủng AGB17 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (6,00 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB4 (3,60 mm), AGB27 (4,20 mm). Đến thời điểm 4 và 5 NSKC giữa các chủng vi khuẩn có sự khác biệt ý nghĩa giống thời điểm 3 NSKC (Hình 3.2). ĐC B AGB4 AGB17 AGB27 ĐC
Hình 3.1 Bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn với nấm Fusarium
moniliforme thời điểm 4 NSKC (A) và 5 NSKC (B).
A AGB4
AGB1 7
22
Bảng 3.2 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với
nấm Curvularia lunata
Qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Thời điểm 3 NSKC, chủng vi khuẩn AGB4 và AGB27 có hiệu suất đối kháng cao (39,60%, 38,80%) và khác biệt có ý nghĩa so với chủng AGB17 (33,40%). Đến thời điểm 4, 5 NSKC hiệu suất đối kháng của ba chủng không khác biệt đều đạt trên 50%. Tuy nhiên, theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng của cả 3 chủng AGB4 (54,20%), AGB17 (50,00%) và AGB27 (52,00%) ở thời điểm 4 NSKC đạt ở mức đối kháng trung bình và đạt mức đối kháng cao ở thời điểm 5 NSKC.
Tóm lại, ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Curvularia lunata qua các thời điểm. Kết quả bán kính vành khăn vô khuẩn thấp hơn ghi nhận của Phan Thị Kiều Nga (2008), bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng AGB4 trên nấm Curvularia spp. là 6,60 mm.
Nghiệm thức
Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 3,60 b 3,20 b 3,00 b 39,60 a 54,20 a 64,20 a AGB17 6,00 a 5,80 a 5,60 a 33,40 b 50,00 a 61,00 a AGB27 4,20 b 3,80 b 3,60 b 38,80 a 52,00 a 62,60 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 30,74 33,51 28,86 11,50 8,27 6,07
Ghi chú: *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % NSKC: Ngày sau khi cấy Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%
23
3.3 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM BIPOLARIS ORYZAE VÀ AGB27 VỚI NẤM BIPOLARIS ORYZAE
Ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm
Bipolaris oryzae thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 3, 4 và 5 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.3). Chủng AGB4 có bán kính vành khăn vô khuẩn cao nhất ở thời điểm 3 NSKC (4,60 mm) khác biệt ý nghĩa so với chủng AGB17 (3,20 mm), AGB27 (3,40 mm). Thời điểm 4 và 5 NSKC các chủng vi khuẩn vẫn có sự khác biệt ý nghĩa giống thời điểm 3 NSKC (Hình 3.3)
Bảng 3.3 Bán kính vành khăn vô khuẩn và hiệu suất đối kháng của ba chủng vi khuẩn đối với
nấm Bipolaris oryzae
Nghiệm thức Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) Hiệu suất đối kháng (%) 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC AGB4 4,60 a 4,20 a 4,00 a 33,60 a 49,20 a 62,60 a AGB17 3,20 b 3,00 b 2,60 b 34,60 a 50,80 a 61,60 a AGB27 3,40 b 3,20 b 2,80 b 38,60 a 51,20 a 61, 00 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 b 0,0 b 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 23,96 22,75 26,06 18,39 10,92 7,41
Ghi chú: *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 %
Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%
AGB4 AGB27
AGB17
ĐC
Hình 3.2 Bán kính vành khăn vô khuẩn của ba chủng vi khuẩn với nấm Curvularia lunata
thời điểm 4 NSKC (A) và 5 NSKC (B).
A B
ĐC
AGB4 AGB27
24
Qua các thời điểm, cả ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17, AGB27 có hiệu suất đối kháng khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. Hiệu suất đối kháng ở từng thởi điểm 3, 4, 5 NSKC của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 không khác biệt nhau, thời điểm 3 NSKC dao động từ 33,60-38,80%. Tuy nhiên, theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng ở thời điểm 3 NSKC của cả 3 chủng AGB4, AGB17 và AGB27 đều đạt ở mức đối kháng yếu. Thời điểm 4 NSKC, chủng AGB17 và AGB27 có hiệu suất đối kháng tăng lên mức đối kháng trung bình (50,80% và 51,20%). Đến thời điểm 5 NSKC cả ba chủng đều có hiệu suất đối kháng trên 60% đạt mức đối kháng cao.
Tóm lại, ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả đối kháng với nấm Bipolaris oryzae qua các thời điểm. Kết quả ghi nhận của Phan Thị Kiều Nga (2008), bán kính vành khăn vô khuẩn của chủng vi khuẩn AGB4 trên nấm
Bipolaris spp. là 6,28 mm cao hơn kết quả ghi nhận ở Bảng 3.3 (4,60 mm).
3.4 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA BA CHỦNG VI KHUẨN AGB4, AGB17 VÀ AGB27 VỚI NẤM PINATUBO ORYZAE VÀ AGB27 VỚI NẤM PINATUBO ORYZAE
Kết quả Bảng 3.4 cho thấy ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 đều có hiệu quả với nấm Pinatubo oryzae thông qua bán kính vành khăn vô khuẩn ở các thời điểm 5, 9 và 12 NSKC khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5%. Bán kính vành khăn vô khuẩn ở từng thời điểm của ba chủng vi khuẩn AGB4, AGB17 và AGB27 khác biệt không ý nghĩa. Thời điểm 5 NSKC, có giá trị cao nhất trong các