. Quy trình phân tích xác định PCBs trên mẫu trầm tích, mẫu nước và mẫu sinh vật chỉ khác nhau về giai đoạn chuẩn bị mẫu, tách chiết, làm giàu mẫu.
a. Chuẩn bị, tách chiết và làm giàu mẫu
Mẫu nước
Lấy 1000mL mẫu nước cho vào phễu chiết thủy tinh 2000mL. Thêm tiếp 50mL dung môi n-hexan. Lắc mạnh trong vòng 10 phút. Để yên dung dịch trong vòng 15 phút, dung dịch sẽ chia làm 2 lớp. Tách lấy lớp n-hexan vào trong bình tam giác 250 mL, lớp nước thu được thực hiện chiết thêm 2 lần như trên, mỗi lần 50mL n-hexan.
Dịch chiết thu được được chuyển vào bình cầu, sử dụng muối Na2SO4 khan để loại bỏ nước còn sót lại trong quá trình chiết, tráng bình tam giác 3 lần bằng dung môi n-hexan. Thực hiện cô quay chân không dịch chiết ở nhiệt độ 55oC về khoảng 5mL rồi được tiến hành làm sạch mẫu.
Mẫu trầm tích
Mẫu trầm tích thu về phòng thí nghiệm ở dạng nhão cần được xử lí sơ bộ trước khi tiến hành tách chiết. Chuyển mẫu ra đĩa, loại bỏ các tạp chất thô có
37
trên mẫu, sau đó để mẫu khô tự nhiên trong điều kiện thường, tránh để ánh nắng chiếu trực tiếp vào mẫu. Nghiền nhỏ mẫu bằng cối mã não.
Cân khoảng 20g mẫu trầm tích đã nghiền nhỏ cho vào lọ thủy tinh thể tích 150mL, thực hiện chiết mẫu với 50mL dung môi n-hexan trong bể chiết siêu âm trong 30 phút. Tiến hành chiết siêu âm 3 lần như trên, dịch chiết thu được chuyển vào bình tam giác 250mL. Thực hiện cô quay chân không dịch chiết thu được ở 55oC về khoảng 5mL rồi tiến hành làm sạch mẫu.
Mẫu sinh vật
Mẫu sinh vật từ tủ bảo quản được lấy ra rã đông. Tiến hành lấy thịt sinh vật bằng dao cho vào cốc thủy tinh 250mL. Dùng máy chuyên dụng xay nhuyễn mẫu thịt sinh vật. Sau đó, cân khoảng 20 – 30g mẫu thịt tiến hành làm khô bằng Na2SO4 khan. Thực hiện chiết siêu âm 3 lần bằng n-hexan, mỗi lần 50mL n- hexan trong 30 phút. Cô quay chân không dịch chiết thu được ở 55oC về khoảng 5mL rồi tiến hành làm sạch mẫu.
b. Làm sạch mẫu
Các mẫu phân tích sau khi đã thực hiện chiết tách và làm giàu mẫu được làm sạch bằng cột sắc kí thủy tinh dài 30cm, đường kính 6mm theo phương pháp nhồi ướt. Phía cuối cột có nút bông thủy tinh dày từ 0,5-1cm. Tiếp theo cho 1g muối Na2SO4 khan vào cột. Nhỏ từ từ n-hexan vào cột để muối Na2SO4 chạy xuống đáy cột và tránh gây tắc cột.
Cân 2g chất hấp phụ silicagel vào trong cốc thủy tinh 50ml. Thêm 10mL dung môi n-hexan vào cốc, khuấy đều hỗn hợp. Cho từ từ hỗn hợp trên vào cột thủy tinh, tránh để phân lớp chất nhồi silicagel gây tắc cột. Rửa sạch cột và chất nhồi bằng dung môi n-hexan trước khi nạp mẫu. Chú ý khi nhồi cột không được để chất nhồi bị khô, luôn phải duy trì lớp dung môi ngập trên chất nhồi.
Khi lớp dung môi rửa cột còn cách lớp chất nhồi khoảng 1cm thì nạp 5mL dịch chiết mẫu đã được làm giàu ở trên vào cột. Dùng khoảng 50mL dung môi n-hexan rửa giải PCBs ra khỏi cột silicagel. Hứng dịch rửa giải vào bình quả nhót rồi đem cô quay chân không ở 55oC về khoảng 1mL.
38
1mL mẫu sau khi cô quay được chuyển vào lọ đựng mẫu 1,5mL. Mẫu phân tích đựng trong lọ được cho bay hơi hoàn toàn, sau đó được hòa tan trở lại bằng n-hexan siêu tinh khiết. Định mức mẫu phân tích đến 1ml và đem đi phân tích trên máy sắc kí detectơ ECD với điều kiện làm việc như sau:
Cột sắc ký mao quản HP5 dài 30m x 0,32mm, pha tĩnh dày 0,25µm. Chế độ bơm mẫu chia dòng.
Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C. Nhiệt độ Detector: 2900C.
Khí mang N2 tinh khiết đến 99,999%. Tốc độ dòng khí N2 qua cột: 0,9 ml/phút Thể tích bơm mẫu 1µl
Chương trình nhiệt độ chạy cột phân tích: Nhiệt độ ban đầu là 800C trong 1 phút, tăng lên đến 2500C với tốc độ 200C/phút, giữ ở 2500C trong 1 phút rồi tăng 50C/phút đến 2900C và giữ ở 2900C trong 5 phút. Tổng thời gian chạy là 23,5 phút, chương trình nhiệt độ cột phân tích được thể hiện trên Hình 6.
Hình 2.6. Chương trình nhiệt độ cột phân tích
Lưu ý, tất cả các dụng cụ thí nghiệm như cốc thủy tinh, bình tam giác, cột thủy tinh, lọ đựng mẫu đều phải được rửa sạch bằng xà phòng, tráng bằng nước cất, sấy khô ở 120oC. Trước khi sử dụng các dụng cụ đều được tráng bằng dung môi n-hexan. Nh iệ t đ ộ ( 0 C) Thời gian (phút)
39
Quy trình phân tích PCBs trong các mẫu nước, trầm tích, thịt ngao lần lượt được tóm tắt trong các Hình 2.7, 2.8, 2.9.
Hình 2.7. Quy trình phân tích hợp chất PCBs trong mẫu nước
1000 mL mẫu nước
Chiết lỏng – lỏng 3 lần bằng n-hexan (3 x 50 mL)
Làm khô bằng Na2SO4 khan
Cô quay chân không về khoảng 5 mL Cột silicagel (2g silicagel + 1g Na2SO4 khan) Làm sạch cột và chất nhồi bằng n-hexan Dịch rửa giải Cô quay về 1mL
Chuyển vào lọ đựng mẫu 1mL
Cho bay hơi hoàn toàn, hòa tan trở lại, định mức đến 1mL
bằng n-hexan siêu tinh khiết
Đo trên máy sắc kí GC/ECD
40
Hình 2.8. Quy trình phân tích hợp chất PCBs trong mẫu trầm tích
Cô quay chân không về 1ml Chiết 3 lần với 150ml n-
hexan trong bể chiết siêu âm
Cột Silicagel (2g Silicagel + 1g Na2SO4
Cô quay chân không đến 5ml
20 g trầm tích khô
Đo trên máy GC/ECD Dịch rửa giải
Chuyển mẫu vào lọ đựng mẫu để bảo quản Làm sạch cột và chất
nhồi với 50ml n-hexan Rửa giải bằng 50ml n- hexan
Loại bỏ dung môi
Loại muối Sunfat bằng đồng miếng đã làm sạch
41
Hình 2.9. Quy trình phân tích hợp chất PCBs trong mẫu thịt ngao
20 -30g mẫu thịt ngao đã được xay nhỏ
Chiết siêu âm 3 lần bằng n-hexan (3 x 50mL) Làm khô bằng Na2SO4 khan
Cô quay chân không về khoảng 5mL Cột silicagel (2g silicagel + 1g Na2SO4 khan) Làm sạch cột và chất nhồi bằng n-hexan Dịch rửa giải Cô quay về 1mL
Chuyển vào lọ đựng mẫu 1mL
Cho bay hơi hoàn toàn, hòa tan trở lại, định mức đến 1mL
bằng n-hexan siêu tinh khiết
Đo trên máy sắc kí GC/ECD
42 2.3. Xây dựng đường chuẩn
Tiến hành pha dung dịch chuẩn từ chất chuẩn hỗn hợp 6 cấu tử PCBs điển hình nồng độ 5000 ng/ml trong n-hexan. Từ hỗn hợp chuẩn nồng độ 5000 ng/ml trên, ta pha thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 300 ng/ml; 90 ng/ml; 60 ng/ml; 30 ng/ml và 15 ng/ml.
- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 300 ng/ml: Lấy 6 ml chất chuẩn hỗn hợp PCBs nồng độ 5000 ng/ml cho vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung môi n-hexan đến vạch mức.
- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 90 ng/ml: Lấy 15 ml chất chuẩn hỗn hợp PCBs nồng độ 300 ng/ml cho vào bình định mức 50 ml, định mức bằng dung môi n-hexan đến vạch mức (dung dịch chuẩn thứ 4).
- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 60 ng/ml: Lấy 20 ml chất chuẩn hỗn hợp PCBs nồng độ 90 ng/ml cho vào bình định mức 30 ml, định mức bằng dung môi n-hexan đến vạch mức (dung dịch chuẩn thứ 3).
- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 30 ng/ml: Lấy 25 ml chất chuẩn hỗn hợp PCBs nồng độ 60 ng/ml cho vào bình định mức 50 ml, định mức bằng dung môi n-hexan đến vạch mức (dung dịch chuẩn thứ 2).
- Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 15 ng/ml: Lấy 25 ml chất chuẩn hỗn hợp PCBs nồng độ 30 ng/ml cho vào bình định mức 50 ml, định mức bằng dung môi n-hexan đến vạch mức (dung dịch chuẩn thứ 1).
2.4. Xác định độ thu hồi
Trong quá trình xác định các hợp chất tách chiết từ môi trường thường có nhiều yếu tố gây ra sự sai lệch kết quả phân tích. Do đó kết quả thu được không phải là giá trị thực của chất cần phân tích, mà cần phải dựa vào độ thu hồi chất của phương pháp. Độ thu hồi chất được xác định dự trên kết quả được xác định chất trong cùng điều kiện của mỗi so sánh với chất chuẩn. Mẫu so sánh được tạo ra từ nền mẫu thực sạch có cho thêm chất chuẩn đã biết trước nồng độ được tiến hành làm sạch như các bước chuẩn bị mẫu.
43 R(%) = 1 2 m m .100% = 1 2 C C . 100% , (2) trong đó: R: Độ thu hồi (%)
m1: Lượng chất chuẩn cho vào mẫu (ng)
m2: Lượng chất chuẩn thu được sau khi qua các bước chuẩn bị mẫu (ng) C1: Nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu (ng)
44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng đường ngoại chuẩn
Từ các dung dịch chuẩn đã pha ở mục 2.3, tiến hành xây dựng đường chuẩn với các nồng độ 15 ng/mL; 30 ng/mL; 60 ng/mL và 90 ng/mL. Lần lượt bơm 1µL các dung dịch chuẩn trên vào máy sắc ký khí. Kết quả nhận được trên sắc đồ là thời gian lưu, số đếm diện tích pic của các PCBs chuẩn, kết quả được đưa ra trên Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả phân tích dung dịch chuẩn để xây dựng đường ngoại chuẩn
STT Cấu tử PCBs Thời gian lưu (phút) Nồng độ (ng/ml) Số đếm diện tích pic (Hz*s) 1 PCB 28 10,260 15 14,56 30 24,47 60 55,98 90 88,24 2 PCB 52 10,580 15 3,93 30 19,84 60 51,47 90 88,66 3 PCB 101 11,462 15 8,55 30 31,53 60 73,94 90 130,26 4 PCB 138 12,764 15 16,02 30 47,62 60 96,89 90 174,74 5 PCB 153 12,430 15 14,05 30 40,21 60 89,22 90 152,01 6 PCB 180 13,712 15 24,27 30 72,21 60 153,12 90 252,16
45
Dựa vào mối tương quan giữa nồng độ và số đếm diện tích pic của cấu tử PCBs để dựng đường chuẩn cho mỗi PCBs xác định. Đường ngoại chuẩn của PCB28, PCB101 được biểu diễn lần lượt trên Hình 3.10, 3.11. Đường ngoại chuẩn của các PCBs còn lại được nêu trong phần Phụ lục 2.
Hình 3.10. Đường ngoại chuẩn của PCB28
Hình 3.11. Đường ngoại chuẩn của PCB101
S ố đ ế m di ệ n tích pic S ố đ ếm di ện t ích pic y = 1.0015x – 2,9483 R2 = 0,9955 y = 1,605x – 17,1548 R2 = 0,9958
46
Dựa trên các đường ngoại chuẩn được trình bày trong Bảng 3.9, có được phương trình định lượng của 6 PCBs điển hình. Các phương trình trong Bảng 10 dưới đây đều có dạng y = ax + b và có hệ số hồi quy R2 > 0,98. Điều đó chứng tỏ độ lớn tín hiệu đo và nồng độ chất có mối quan hệ thuật rất chặt chẽ, mức độ tuyến tính cao tức là cho thấy độ tin cậy của phương pháp rất cao khi xác định, định lượng PCBs. Các phương trình đường chuẩn này sử dụng để định lượng PCBs trong các mẫu thực tế.
Bảng 3.10. Phương trình định lượng 6 PCBs điển hình
STT Cấu tử PCBs Phương trình đường chuẩn Hệ số hồi quy R2
1 PCB 28 y = 1,0015x – 2,9483 0,9955 2 PCB 52 y = 1,244x – 13,839 0,9983 3 PCB 101 y = 1,605x – 17,1548 0,9958 4 PCB 138 y = 2,0684x – 17,0168 0,9897 5 PCB 153 y = 1,8218x – 14,9388 0,9966 6 PCB 180 y = 2,9985x – 20,735 0,9982
3.2. Độ thu hồi chất của phương pháp
Tiếp tục phân tích mẫu chuẩn và mẫu so sánh đã qua các bước chuẩn bị mẫu trên GC/ECD. Dựa vào thời gian lưu và phương trình định lượng nêu ở Bảng 3.10 để xác định sự có mặt và nồng độ của các PBCs trong các mẫu này. Sử dụng công thức (2) để tính toán độ thu hồi chất của phương pháp. Độ thu hồi chất được tính dựa trên kết quả tính trung bình của 3 lần phân tích mẫu chuẩn và mẫu so sánh. Kết quả tính toán được nêu trong Bảng 3.11.
47
Bảng 3.11. Độ thu hồi của phương pháp đối với PCBs trên GC/ECD
Cấu tử PCBs
Nồng độ chất trong mẫu chuẩn (ng/mL)
Nồng độ chất trong
mẫu so sánh Độ thu hồi R (%)
PCB 28 67,29 63,66 94,60 PCB 52 59,71 48,41 81,08 PCB 101 49,86 42,50 85,93 PCB 138 49,46 42,66 86,25 PCB 153 50,75 46,55 91,72 PCB 180 36,77 35,13 95,53
Đối với phương pháp này thông thường độ thu hồi nằm trong khoảng 40% - 140% là đạt yêu cầu. Nhìn vào Bảng 3.11, có thể thấy độ thu hồi đối với các PCBs đều lớn hơn 81% (từ 81,08% đến 95,53%). Dựa vào kết quả nhận được từ việc phân tích mẫu chuẩn và mẫu so sánh ta thấy độ thu hồi của phương pháp là khá cao. Trong đó độ thu hồi của PCB 52 là thấp nhất (81,08%), của PCB 180 là cao nhất (95,53%), các PCBs còn lại có độ thu hồi đều trên 85%. Với các giá trị độ thu hồi đã xác định được, có thể áp dụng quy trình chuẩn bị mẫu và các điều kiện phân tích trên GC/ECD đã xây dựng để xác định nồng độ PCBs trong các mẫu trầm tích.
3.3. Kết quả phân tích PCBs trong các mẫu trầm tích, nước, sinh vật khu vực cảng Hải Phòng vực cảng Hải Phòng
Trên cơ sở kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp nêu trong mục 3.2, nồng độ các PCBs điển hình trong mẫu trầm tích, thịt ngao lấy ở các vị trí thuộc khu vực cảng Hải Phòng được xác định theo công thức:
= , (3) trong đó: C2 (ng/mL). VC(mL) m (g). R (%) C1 (ng/g)
48
C1: Nồng độ PCBs trong mẫu trầm tích, mẫu thịt ngao (ng/g),
C2: Nồng độ PCBs xác định được từ quá trình chuẩn bị mẫu (ng/mL), VC: Thể tích của dịch cô mẫu cuối cùng (mL),
m: Khối lượng trầm tích, thịt ngao lấy phân tích (g), R: Độ thu hồi của mỗi PBCs cần xác định nồng độ C1 (%)
Mẫu nước
Nồng độ của PCBs trong mẫu nước được xác định theo công thức: C1 = R V V C C . . 2 , (4) trong đó: C1 - Nồng độ PCBs trong mẫu thực tế (ng/mL);
C2 - Nồng độ PCBs xác định từ phương trình đường chuẩn (ng/mL); Vc - Thể tích dung dịch đem phân tích trên máy sắc kí (mL);
V - Thể tích mẫu nước chiết ban đầu (mL) (V = 1000mL); R - Độ thu hồi (%).
3.4. Nồng độ PCBs trong mẫu trầm tích
Trên cơ sở độ thu hồi, khối lượng của từng mẫu trầm tích nghiên cứu và dựa theo công thức (3) có được kết quả nồng độ PCBs trong trầm tích được nêu trong Bảng 3.12.
Bảng 3.12. Nồng độ PCBs trong mẫu trầm tích khu vực cảng
Khu vực Đơn vị PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 138 PCB 153 PCB 180 Tổng PCBs C. Đình Vũ ng/g 0,12 1,27 1,24 1,12 1,39 0,15 5,29 C. Chùa Vẽ ng/g 0,09 0,91 0,62 0,81 0,87 0,08 3,38 C. Hoàng Diệu ng/g 0,05 0,5 0,31 0,52 0,42 0,04 1,84 C. Vật Cách ng/g 0,08 0,82 0,68 0,71 0,8 - 3,09 Phà Đình Vũ ng/g 0,09 1,02 0,79 0,87 0,79 - 3,56 TB Kvực ng/g 0,43 4,52 3,63 4,03 4,27 0,27 3,432
49
Ghi chú: “- ” : Không xuất hiện
Dựa vào số liệu Bảng 3.12, nồng độ từng cấu tử PCBs trong mẫu trầm tích ở các khu vực được mô tả trên biểu đồ Hình 3.12.
0 1 2 3 4 5 6 C. Đình Vũ C. Chùa Vẽ C. Hoàng Diệu C. Vật Cách Phà Đình Vũ PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 138 PCB 153 PCB 180 Tổng PCBs Hình 3.12. Nồng độ PCBs trong trầm tích
Từ kết quả thu được trong Bảng 3 . 12 v à H ì n h 3 . 1 2 cho thấy, hàm lượng tổng PCBs trong mẫu trầm tích cao nhất ở Cảng Đình Vũ (5,29 ng/g), thấp nhất ở Cảng Hoàng Diệu (1,84 ng/g). Hàm lượng PCB 153 trong mẫu trầm tích cũng có giá trị lớn nhất, hàm lượng PCB 180 có giá trị nhỏ nhất trong hàm lượng tổng PCBs trong các khu vực. Sự chênh lệch giữa hàm lượng các cấu tử PCB 28 và PCB 180 với các cấu tử PCB 52, PCB101, PCB 138, PCB 153 trong cùng một khu vực rất lớn. Tại khu vực Cảng Vật Cách và Phà Đình
Vũ không thấy sự xuất hiện của PCB 180.