2.2.2.1. Chủng nấm
Mẫu nấm Isaria tenuipes thu thập ở VQG Pù Mát
2.2.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy
Các mẫu vật thu thập được phân loại và đánh giá dưới kính hiển vi điện tử theo phương pháp Lacey and Brooks (1997) [38]. Phân lập sử dụng theo phương pháp của Goettel và Inglis (1997) [22]. Phân lập các bào tử đơn dựa theo phương pháp của Choi và cs. (1997) [17].
Cấy chuyển sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) theo phương pháp của Brown and Smith (1957) [16] và Samson (1974). Đặc điểm hình thái của bào tử, sợi, cấu trúc quả thể và một số đặc điểm sinh học khác được đánh giá, nhận dạng các loài ký sinh côn trùng theo phương pháp của Samson và cs. (1988) [46]; Kobayasi và Shimizu (1983) [37]; Luangsa - ard và cs. (2007) [39] và Sung và cs. (2007) [49 ].
• Phân loại sơ bộ mẫu nấm ngay sau khi thu thập
Mẫu EPF sau khi thu thập phải tiến hành phận loại ngay trên thực địa và phải chú ý quan sát hình thái bên ngoài, màu sắc, hình dạng, dạng sinh sản hữu tính hay vô tính để xác định cách phân loại (có thể dựa vào vật chủ để phân loại nếu chưa xác định mẫu rõ ràng).
Đánh ký hiệu số thứ tự cho các mẫu EPF và định loại chúng theo giống (genus); vẽ và ghi thông tin về mẫu vào sổ (chiều dài và chiều rộng quả thể, số quả thể, màu sắc quả thể, chiều dài và chiều rộng synnema, số synnema và màu sắc); ký chủ (chiều dài và chiều rộng vật chủ…), cây cỏ, nơi thu thập, người thu thập, địa điểm thu thập, tọa độ địa lý (GIS).
Đối với những mẫu bẩn, dùng cồn 75% vệ sinh sơ bộ để tránh nhiễm khuẩn trong quá trình phân lập. Đặc biệt là những mẫu sinh sản hữu tính như Hypocrella,
Moelleriella, Samuelsia, Torrubiella, Cordyceps và Ophiocordyceps. • Chuẩn bị môi trường PDA
Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bao gồm các thành phần sau:
Khoai tây (Potato) 200 gam
Đường Glucozơ 20 gam
Agar 20 gam
Nước cất 1000 ml
• Phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường PDA
Bước 1. Chuẩn bị môi trường (PDA có thêm chất kháng sinh), các dụng cụ để
phân lập và nuôi cấy.
Bước 2. Mẫu đã hình thành bào tử phải phân lập ngay, mẫu non có thể để sau
vài ngày và quan sát sự hình thành bào tử.
Bước 1. Khoai tây được rửa sạch và gọt vỏ, để ráo nước
Bước 2. Cân 200g và cắt nhỏ theo kích thước 1,0 x 1,0 cm rồi cho vào nồi cùng
1000ml nước cất, nấu mềm trong khoảng 45 phút đến 1 giờ.
Bước 3. Lọc lấy dịch chiết và thêm vào 20g glucose + 15g agar + lượng nước
sao cho đủ 1000ml, cho lên bếp từ, vừa đun nóng vừa cho con khuấy từ đánh tan đều.
Bước 4. Cho vào một cái chai loại 1000ml có nắp kín, đem hấp tiệt trùng ở 1210, 20p, 15psi.
Bước 3. Dùng dụng cụ phân lập đã vô trùng để lấy bào tử rồi rải đều trên đĩa môi trường hoặc đặt nghiêng trên đĩa Petri để cho phóng bào tử và đánh dấu vị trí đó.
Bước 4. Mẫu sau khi phân lập được bảo quản trong tủ nuôi cấy ở 20-250 hoặc
trong hộp nhựa có lót lớp giấy ẩm.
Hàng ngày quan sát sự nảy mầm của bào tử dưới kính hiển vi soi nổi.
• Cấy chuyển bảo tử nấm nảy mầm sang PDA trên đĩa Petri
Sau khi phân lập trên PDA, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi soi nổi để tìm ra bào tử nảy mầm. Dùng dụng cụ nuôi cấy đã vô trùng cắt nhanh phần môi trường có chứa bào tử và chuyển sang đĩa PDA sạch khác (cấy chuyển tiếp sang đĩa khác nếu đĩa vẫn bị tạp nhiễm).