• Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nội dung sau:
+ Lựa chọn ra môi trường giống lỏng (từ môi trường SDY, YM và PDB tốt nhất để phục vụ cho việc lây nhiễm trên cơ thể nhộng tằm.
+ Lựa chọn phương pháp lây nhiễm (tiêm, phun) trên cơ thể nhộng
+ Lựa chọn nồng độ bào tử (104, 105, 106 cfu/ml) thích hợp nhất cho việc lây nhiễm.
+ So sánh hai mức cường độ ánh sáng là ánh sáng tự nhiên và ánh sáng đèn 200lux, nhằm đánh giá ảnh hưởng của cường độ ánh sáng.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và được tiến hành theo phương pháp của Pil-Don Kang, In-Pyo Hong và cs. (2010) và Sang Mong Lee và cs. (2001).
• Chuẩn bị giống lỏng để tiêm
Môi trường PDB (PDA không có agar) được đánh giá là môi trường phù hợp cho sản xuất giống lỏng. 100ml môi trường PDB trong bình tam giác đem hấp khử trùng tại
121oC, 15 phút, để nguội rồi cấy 4 – 5 mm2 khuẩn lạc rồi đem nuôi trên máy lắc ở 150
vòng/phút tại nhiệt độ 25 ± 1oC trong thời gian 5 – 6 ngày.
Sau đó được lọc qua gạc hoặc vỉ lọc vô trùng để lấy hyphal bodies và loại bỏ
nhứng váng nấm rồi pha loảng để có được nồng độ từ 104 – 106 cfu/ml.
• Lây nhiễm nấm vào nhộng
Xác định số lượng bào tử
Nồng độ bào tử nấm được xác định bằng buồng đếm hồng cầu.
- Đó là 1 lam kính dày (kích thước 7 cm x 3 cm x 0.5 cm), có 4 rãnh ngang và 1 rãnh dọc, có 225 ô vuông lớn. Trong đó có 25 ô lớn chính giữa được chia thành các ô vuông nhỏ (1 ô lớn có 16 ô nhỏ).
- Kích thước của mỗi ô nhỏ như sau: mỗi cạnh bằng 1/20 mm và sâu 1/10 mm.
- Thể tích của 1 ô vuông nhỏ là: 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 (mm3)
Phương pháp đếm
- Đối với môi trường PDA lấy phần khuẩn lạc của nấm cho vào 1 cốc đong
nhỏ cùng với 10ml nước cất 2 lần. Dùng đũa thủy tinh khuấy để cho các bào tử hòa tan vào trong nước.
- Đối với môi trường lên men xốp: Lấy 1g hỗn hợp cơ chất môi trường cho vào cốc đong nhỏ với 10ml nước cất 2 lần. Dùng đũa thủy tinh đánh đều.
- Sau đó, dùng lưới lọc mịn (tấm lưới lọc của Nhật Bản) lọc hỗn hợp dung
dịch vừa pha chế để đảm bảo chỉ có bào tử được lọt qua. Nhỏ vào dịch lọc 1 - 2 giọt
hỗn hợp gồm Tween 80 và cồn 960 với tỷ lệ 1 : 1, khuấy đều. Hỗn hợp này có tác
dụng giúp ổn định các bào tử trong dịch lọc để đễ dàng cho việc đếm hơn.
- Nhỏ 1 giọt bào tử đã pha loãng lên buồng đếm, đậy lamen lên, dùng giấy thấm để thấm những dịch thừa xung quanh.
- Đặt buồng đếm lên kính hiển vi điều chỉnh kính hiển vi ở vật kính 40x. - Đếm số lượng bào tử trong 5 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ.
Công thức tính bào tử:
- Tiến hành đếm 2 lần ( số bào tử là a,b) và tính trung bình bào tử của 2 lần đếm: X = ( a + b)/2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cho 0,1µl của dịch bào tử vào 25 ô vuông:
Nồng độ bào tử trong 1 ml (c) = X.5.104.
C: Nồng độ bào tử trong dịch nấm gốc c: Nồng độ bào tử trong 1ml dung dịch.
n: Hệ số pha loãng (đơn vị tính: lần).
• Lây nhiễm nấm trên cơ thể vật chủ (nhộng tằm)
Phương pháp phun nhiễm
* Chuẩn bị ấu trùng tằm
Chú ý: tằm và giống nấm được chuẩn bị trước một ngày khi tiêm nhiễm - Chuẩn bị đủ lượng lá dâu cho tằm ăn trong thời gian tằm sắp hóa kén - Tằm sau khi phun nhiễm được nuôi trên các giá
* Phương pháp phun nhiễm
Tằm ngày đầu tiên của tuổi 4 được sử dụng để tiêm nhiễm.
- Chuẩn bị: Lấy tằm tuổi 4 loại bỏ những con không đạt tiêu chuẩn. Chuyển tằm sang dụng cụ nuôi đã được vệ sinh để chúng hóa nhộng.
- Tiêm nhiễm: Pha dung dịch nấm với nồng độ 106 cfu/ml với Tween 20 hoặc
dầu ăn để tạo sự bám dính trên bề mặt tằm. Phun lên tằm khoảng 3 lần trong 12-16h.
Phủ lớp lá dâu lên số tằm đã được phun nhiễm. Tằm được nuôi ở 260C . Sau 6 ngày
tằm hóa nhộng hết. Nhộng sau 11 ngày được cắt ra, kiểm tra loại bỏ những con mềm, hỏng. Những con cứng lại là đã bị nhiễm nấm và đem đặt trên lớp giấy ẩm (vải
ẩm) ở khoảng cách nhau 1cm2 trong hộp nhựa trong suốt.
Tiếp tục nuôi ở 25 ± 10C, RH= 70-75% ở điều kiện tối trong khoảng 5-7 ngày
để sợi nấm phủ kín bề mặt nhộng. Khi sợi nấm đã phủ kín bề mặt nhộng thì chuyển
mức nhiêt độ xuống 19±10C và chu kỳ sang tối là 16L/8D, cường độ chiếu sáng là
300 Lux, RH= 90-95%.
Dùng xilanh tiệt trùng lấy 100µl bào tử có nồng độ 104 – 106 hyphal cfu/ml tiêm vào khoang máu ở dưới da trên phần ngực của nhộng. Nhộng sau khi tiêm được
đặt vào các hộp nhựa cách nhau 3 cm2 có trải một lớp giấy thấm nước để tạo độ ẩm
cho nhộng. Các hộp được đem nuôi ở nhiệt độ 25 ± 1oC, ẩm độ 80% cho đến khi
nhộng trở nên cứng rắn rồi chuyển chế độ nuôi sang 20 ± 1oC, ẩm độ 90% trong chế
độ 16 giờ sáng/8 giờ tối với cường độ chiếu sáng 600 lux bằng bóng đèn huỳnh quang 15 – 18 w.